Title (eng)
Cryofixed Artemia
a new approach to better ultrastructure
Parallel title (deu)
Kryofixierte Artemia : ein neuer Ansatz zur besseren Ultrastruktur
Author
Elena Hollergschwandtner
Advisor
Waltraud Klepal
Assessor
Waltraud Klepal
Abstract (deu)
Artemia franciscana (Crustacea: Branchiopoda) kann, kontrolliert durch die aktuellen Umwelteinflüsse, zwischen zwei verschiedenen reproduktiven Wegen wählen. Das adulte Weibchen produziert bei günstigen Umständen Embryonen, die sofort nach der vollendeten Entwicklung zu schlüpfen (ovoviviparie), oder metabolisch inaktive Embryonen, namentlich „Cysten“, entwickeln sich, welche im Gastrula Stadium ihrer Entwicklung stoppen. Diese „Cysten“ können das saisonale Austrocknen ihres Habitats überleben, um sich dann wieder durch Wasserzufuhr weiterzuentwickeln. Durch eine vielschichtige Eischale sind sie vor aggressiven Umwelteinflüssen ohne Wasser geschützt.
Naturwissenschaftler sind fasziniert von den Überlebensstrategien von Artemia franciscana. Daher dient die Eientwicklung der „Cysten“ als gutes Beispiel zum Studium der Diapause. In früheren Studien wurde durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) über die Morphologie der Reproduktionsorgane und die Prozesse der Fertilisation, Vitellogenese und Oogenese berichtet. Dennoch sind bestehende Daten teilweise durch Fixierungsprobleme, wie Extraktion von Zellmaterial, behaftet. Vor allem die Dauereier der Krebstiere sind durch ihre dicke, vielschichtige Eischale schwer mit der konventionellen chemischen Methode für TEM zu fixieren, da sie das Eindringen der Fixative verhindert.
Durch einen neuen Versuch das Gewebe in einer besseren Qualität darzustellen, wurde in dieser Studie wurde das Gewebe von Artemia franciscana mittels Cryofixierung generiert. Proben wurden per „High Pressure Freezing“ (HPF) und anschließender „Automatic Freeze Substitution“ mit einer Osmium/ Aceton Mischung behandelt und anschließen in „Low Viscosity Resin“ eingebettet. Durch diese Methode konnte die Ultrastruktur der Zellen erhalten und typische Artefakte, die durch die chemische Fixierung bei Raumtemperatur entstehen, vermieden werden. Außerdem wurde auch die Beschleunigung des Substitutionsprozesses, durch die Zuführung eines Agitationsmoduls, ermittelt. Neben der Erforschung der Ultrastruktur von A. franciscana, kann die Methode der Cryofixierung auch für andere Proben, die ähnliche Probleme während der chemischen Fixierung aufweisen, verwendet werden.
Abstract (eng)
The crustacean Artemia franciscana is able to switch between two different reproductive ways controlled by environmental cues: adult females can produce embryos in their ovisac, coated with a thin cuticle shell layer, ready to hatch immediately or metabolically inactive eggs, namely cysts, which undergo diapause in a late gastrula stage. These cysts can overcome desiccation of the habitat to reactivate and develop later, when rehydration is possible. For protection against harsh environmental conditions without water, the cysts are coated with a multilayered eggshell.
Scientists are attracted by the survival strategies of A. franciscana. They use this species as a model for studying egg development, which culminates in diapause. Transmission electron microscopy (TEM) has already provided insights concerning the internal and external morphology of reproductive organs, and processes such as fertilization, vitellogenesis and oogenesis. However, it cannot be overlooked, that the TEM data generated so far are overlaid by fixation problems and excessive extraction of biological material. Especially cysts, coated with a multilayered cuticle, hamper entrance of chemical fixatives and resin monomers commonly used for conventional TEM sample preparation.
Here, data are generated by a different approach of sample preparation for tissue of A. franciscana that is based on cryopreparation. The samples were processed by high-pressure freezing (HPF) and subsequent freeze substitution (FS) in OsO₄/ acetone and embedded in low viscosity resin. It is shown to what extent freezing techniques can help to preserve the ultrastructure of cells and tissues in involved in reproduction, like dissected ovisacs.
Furthermore, a possibility is demonstrated to accelerate the substitution process with overnight protocols, by application of an agitation module for automatized freeze substitution.
Although aimed at the cryoprocessing of Artemia franciscana, the approach chosen here could also be useful for ultrastructural studies of other specimens with similar resistance to conventional chemical sample preparation at room temperature.
Keywords (eng)
Artemia franciscanaCryofixationTEMAutomatic freeze substitution
Keywords (deu)
Artemia franciscanaKryofixierungTEMAutomatische Gefriersubstitution
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1326846
rdau:P60550 (deu)
57 Seiten : Illustrationen
Number of pages
57
Association (deu)
Title (eng)
Cryofixed Artemia
a new approach to better ultrastructure
Parallel title (deu)
Kryofixierte Artemia : ein neuer Ansatz zur besseren Ultrastruktur
Author
Elena Hollergschwandtner
Abstract (deu)
Artemia franciscana (Crustacea: Branchiopoda) kann, kontrolliert durch die aktuellen Umwelteinflüsse, zwischen zwei verschiedenen reproduktiven Wegen wählen. Das adulte Weibchen produziert bei günstigen Umständen Embryonen, die sofort nach der vollendeten Entwicklung zu schlüpfen (ovoviviparie), oder metabolisch inaktive Embryonen, namentlich „Cysten“, entwickeln sich, welche im Gastrula Stadium ihrer Entwicklung stoppen. Diese „Cysten“ können das saisonale Austrocknen ihres Habitats überleben, um sich dann wieder durch Wasserzufuhr weiterzuentwickeln. Durch eine vielschichtige Eischale sind sie vor aggressiven Umwelteinflüssen ohne Wasser geschützt.
Naturwissenschaftler sind fasziniert von den Überlebensstrategien von Artemia franciscana. Daher dient die Eientwicklung der „Cysten“ als gutes Beispiel zum Studium der Diapause. In früheren Studien wurde durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) über die Morphologie der Reproduktionsorgane und die Prozesse der Fertilisation, Vitellogenese und Oogenese berichtet. Dennoch sind bestehende Daten teilweise durch Fixierungsprobleme, wie Extraktion von Zellmaterial, behaftet. Vor allem die Dauereier der Krebstiere sind durch ihre dicke, vielschichtige Eischale schwer mit der konventionellen chemischen Methode für TEM zu fixieren, da sie das Eindringen der Fixative verhindert.
Durch einen neuen Versuch das Gewebe in einer besseren Qualität darzustellen, wurde in dieser Studie wurde das Gewebe von Artemia franciscana mittels Cryofixierung generiert. Proben wurden per „High Pressure Freezing“ (HPF) und anschließender „Automatic Freeze Substitution“ mit einer Osmium/ Aceton Mischung behandelt und anschließen in „Low Viscosity Resin“ eingebettet. Durch diese Methode konnte die Ultrastruktur der Zellen erhalten und typische Artefakte, die durch die chemische Fixierung bei Raumtemperatur entstehen, vermieden werden. Außerdem wurde auch die Beschleunigung des Substitutionsprozesses, durch die Zuführung eines Agitationsmoduls, ermittelt. Neben der Erforschung der Ultrastruktur von A. franciscana, kann die Methode der Cryofixierung auch für andere Proben, die ähnliche Probleme während der chemischen Fixierung aufweisen, verwendet werden.
Abstract (eng)
The crustacean Artemia franciscana is able to switch between two different reproductive ways controlled by environmental cues: adult females can produce embryos in their ovisac, coated with a thin cuticle shell layer, ready to hatch immediately or metabolically inactive eggs, namely cysts, which undergo diapause in a late gastrula stage. These cysts can overcome desiccation of the habitat to reactivate and develop later, when rehydration is possible. For protection against harsh environmental conditions without water, the cysts are coated with a multilayered eggshell.
Scientists are attracted by the survival strategies of A. franciscana. They use this species as a model for studying egg development, which culminates in diapause. Transmission electron microscopy (TEM) has already provided insights concerning the internal and external morphology of reproductive organs, and processes such as fertilization, vitellogenesis and oogenesis. However, it cannot be overlooked, that the TEM data generated so far are overlaid by fixation problems and excessive extraction of biological material. Especially cysts, coated with a multilayered cuticle, hamper entrance of chemical fixatives and resin monomers commonly used for conventional TEM sample preparation.
Here, data are generated by a different approach of sample preparation for tissue of A. franciscana that is based on cryopreparation. The samples were processed by high-pressure freezing (HPF) and subsequent freeze substitution (FS) in OsO₄/ acetone and embedded in low viscosity resin. It is shown to what extent freezing techniques can help to preserve the ultrastructure of cells and tissues in involved in reproduction, like dissected ovisacs.
Furthermore, a possibility is demonstrated to accelerate the substitution process with overnight protocols, by application of an agitation module for automatized freeze substitution.
Although aimed at the cryoprocessing of Artemia franciscana, the approach chosen here could also be useful for ultrastructural studies of other specimens with similar resistance to conventional chemical sample preparation at room temperature.
Keywords (eng)
Artemia franciscanaCryofixationTEMAutomatic freeze substitution
Keywords (deu)
Artemia franciscanaKryofixierungTEMAutomatische Gefriersubstitution
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1326847
Number of pages
57
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