Title (eng)
Development of an ECLIA based assay for MeCP2 protein
Parallel title (deu)
Entwicklung eines ECLIA basierten Assays für das MeCP2 Proteins
Author
Anna Katharina Schönegger
Advisor
Franco Laccone
Assessor
Franco Laccone
Abstract (deu)
Hintergrund: Das Rett Syndrom ist eine schwere, neurologische Entwicklungsstörung, die bei Mädchen mit einer Prävalenz von 1:10.000 auftritt. Als Ursache für diese Erkrankung wurde eine Mutation im MeCP2-Gen lokalisiert, die mit einem Funktionsverlust des dazugehörigen Proteins einhergeht. Die Entwicklung potentieller Therapieoptionen ist jedoch immer noch Gegenstand der Forschung. Derzeit wird die Idee einer Proteinersatztherapie mittels eines TAT-MeCP2-Fusionsproteins näher untersucht. Dies bedarf natürlich auch eines neuen diagnostischen Tools, um den Effekt dieser Behandlungsmethode quantitativ zu beurteilen. Darum setzten wir uns in dieser Arbeit die Entwicklung eines Elektrochemilumineszenz-Immunoassays (ECLIA) für die quantitative Bestimmung von endogenem MeCP2 als auch des TAT-MeCP2 Fusionsproteins im Zell- und Tiermodell, zum Ziel.
Methoden: Es wurde eine Carbon-beschichtete 96-well Mikroplatte eingesetzt, die mit einem Ru(bpy)32+/TPA-Elektrochemilumineszenz-System verknüpft wurde. Für die Quantifizierung von MeCP2 erfolgte die Probenaufbereitung mittels Kernextraktion. Es wurden sowohl Wildtyp-Mausgewebe und -zelllinien als auch jene mutierter Herkunft untersucht.
Ergebnisse: Der MeCP2-ECLIA zeichnete sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus. Die untere Bestimmungsgrenze (LLOD) lag dabei bei 28.5pg/ml. Auch hinsichtlich der Genauigkeit erfüllte der ECLIA mit eine Intra-Assay Präzision von CV≤1.21% sowie eine Inter-Assay Präzision von CV≤12.5% entsprechende Anforderungen. Ferner konnten mittels ELCIA in Wildtyp-Fibroblasten deutlich höhere MeCP2-Konzentrationen gemessen werden, als in den von männlichen Rett Syndrom Patienten stammenden Zellen. Bei den Messungen in Maushirnen wurden in den Hirnen von MeCP2-Knockout-Mäusen, im Gegensatz zu jenen von Wildtypen, keine Signale gemessen. Hirne von heterozygoten Mäusen zeigten um 40% verringerte MeCP2-Levels, verglichen mit den Wildtyp-Mäusen.
Schlussfolgerung: Die Verfügbarkeit eines solch neuen Tools für die Quantifizierung von endogenem als auch TAT-MeCP2-Fusionsproteins stellt ein vielversprechendes diagnostisches Agens, für zukünftige Forschung im Bereich der Proteinersatztherapie sowie anderer Therapieoptionen im Zuge des Rett Syndroms, dar.
Abstract (eng)
Background: Rett syndrome is a severe neurodevelopmental disease, occurring in one out of every 10.000 female births. It is mainly caused by mutations in the MeCP2 gene, leading to the corresponding protein’s loss of function. Potential therapeutical approaches still require research. A possible protein replacement strategy, using the TAT-MeCP2 fusion protein is currently being investigated, thus bringing up the need for a diagnostic tool to assess the effect of this potential agent. Here we report on developing an electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) for quantifying endogenous MeCP2 as well as the TAT-MeCP2 fusion protein in cellular and animal models.
Methods: A carbon coated 96-well high-bind microplate associated with an Ru(bpy)32+/TPA-ECL-system was used. Sample preparation followed nuclear extraction strategies of different human and animal cell lines as well as mouse tissues in order to determine MeCP2 concentrations. Herein, both mutant and wild-type samples were investigated.
Results: The ECLIA is characterized by a high sensitivity and specificity, showing a lower detection limit (LLOD) of 28.5pg/ml. In terms of accuracy, an intra-assay precision (CV≤1.21%) as well as inter-assay precision (CV≤12.5%) was successfully achieved. Marked differences in MeCP2 concentration were observed between wild-type fibroblasts and male Rett patients’ fibroblasts. Comparing MeCP2 levels in wild-type as well as MeCP2-knock out mice brains, the latter did not show any MeCP2 signal. In contrast, MeCP2 concentrations could be measured over a broad range (1-20µg protein/well) in wild-type mice brains. Heterozygous mouse brains gave rise to intermediate MeCP2 values showing a 40% lower MeCP2 concentration than the wild-type mice brains.
Conclusion: The availability of this new tool for quantifying endogenous MeCP2 as well as TAT-MeCP2 fusion protein, serves as a promising diagnostic agent for further research in replacement strategies as well as other investigations in the course of treating Rett syndrome.
Keywords (eng)
Rett syndromeMeCP2ECLIA
Keywords (deu)
Rett SyndromMeCP2ECLIA
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1335082
rdau:P60550 (deu)
95 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
101
Association (deu)
Title (eng)
Development of an ECLIA based assay for MeCP2 protein
Parallel title (deu)
Entwicklung eines ECLIA basierten Assays für das MeCP2 Proteins
Author
Anna Katharina Schönegger
Abstract (deu)
Hintergrund: Das Rett Syndrom ist eine schwere, neurologische Entwicklungsstörung, die bei Mädchen mit einer Prävalenz von 1:10.000 auftritt. Als Ursache für diese Erkrankung wurde eine Mutation im MeCP2-Gen lokalisiert, die mit einem Funktionsverlust des dazugehörigen Proteins einhergeht. Die Entwicklung potentieller Therapieoptionen ist jedoch immer noch Gegenstand der Forschung. Derzeit wird die Idee einer Proteinersatztherapie mittels eines TAT-MeCP2-Fusionsproteins näher untersucht. Dies bedarf natürlich auch eines neuen diagnostischen Tools, um den Effekt dieser Behandlungsmethode quantitativ zu beurteilen. Darum setzten wir uns in dieser Arbeit die Entwicklung eines Elektrochemilumineszenz-Immunoassays (ECLIA) für die quantitative Bestimmung von endogenem MeCP2 als auch des TAT-MeCP2 Fusionsproteins im Zell- und Tiermodell, zum Ziel.
Methoden: Es wurde eine Carbon-beschichtete 96-well Mikroplatte eingesetzt, die mit einem Ru(bpy)32+/TPA-Elektrochemilumineszenz-System verknüpft wurde. Für die Quantifizierung von MeCP2 erfolgte die Probenaufbereitung mittels Kernextraktion. Es wurden sowohl Wildtyp-Mausgewebe und -zelllinien als auch jene mutierter Herkunft untersucht.
Ergebnisse: Der MeCP2-ECLIA zeichnete sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus. Die untere Bestimmungsgrenze (LLOD) lag dabei bei 28.5pg/ml. Auch hinsichtlich der Genauigkeit erfüllte der ECLIA mit eine Intra-Assay Präzision von CV≤1.21% sowie eine Inter-Assay Präzision von CV≤12.5% entsprechende Anforderungen. Ferner konnten mittels ELCIA in Wildtyp-Fibroblasten deutlich höhere MeCP2-Konzentrationen gemessen werden, als in den von männlichen Rett Syndrom Patienten stammenden Zellen. Bei den Messungen in Maushirnen wurden in den Hirnen von MeCP2-Knockout-Mäusen, im Gegensatz zu jenen von Wildtypen, keine Signale gemessen. Hirne von heterozygoten Mäusen zeigten um 40% verringerte MeCP2-Levels, verglichen mit den Wildtyp-Mäusen.
Schlussfolgerung: Die Verfügbarkeit eines solch neuen Tools für die Quantifizierung von endogenem als auch TAT-MeCP2-Fusionsproteins stellt ein vielversprechendes diagnostisches Agens, für zukünftige Forschung im Bereich der Proteinersatztherapie sowie anderer Therapieoptionen im Zuge des Rett Syndroms, dar.
Abstract (eng)
Background: Rett syndrome is a severe neurodevelopmental disease, occurring in one out of every 10.000 female births. It is mainly caused by mutations in the MeCP2 gene, leading to the corresponding protein’s loss of function. Potential therapeutical approaches still require research. A possible protein replacement strategy, using the TAT-MeCP2 fusion protein is currently being investigated, thus bringing up the need for a diagnostic tool to assess the effect of this potential agent. Here we report on developing an electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) for quantifying endogenous MeCP2 as well as the TAT-MeCP2 fusion protein in cellular and animal models.
Methods: A carbon coated 96-well high-bind microplate associated with an Ru(bpy)32+/TPA-ECL-system was used. Sample preparation followed nuclear extraction strategies of different human and animal cell lines as well as mouse tissues in order to determine MeCP2 concentrations. Herein, both mutant and wild-type samples were investigated.
Results: The ECLIA is characterized by a high sensitivity and specificity, showing a lower detection limit (LLOD) of 28.5pg/ml. In terms of accuracy, an intra-assay precision (CV≤1.21%) as well as inter-assay precision (CV≤12.5%) was successfully achieved. Marked differences in MeCP2 concentration were observed between wild-type fibroblasts and male Rett patients’ fibroblasts. Comparing MeCP2 levels in wild-type as well as MeCP2-knock out mice brains, the latter did not show any MeCP2 signal. In contrast, MeCP2 concentrations could be measured over a broad range (1-20µg protein/well) in wild-type mice brains. Heterozygous mouse brains gave rise to intermediate MeCP2 values showing a 40% lower MeCP2 concentration than the wild-type mice brains.
Conclusion: The availability of this new tool for quantifying endogenous MeCP2 as well as TAT-MeCP2 fusion protein, serves as a promising diagnostic agent for further research in replacement strategies as well as other investigations in the course of treating Rett syndrome.
Keywords (eng)
Rett syndromeMeCP2ECLIA
Keywords (deu)
Rett SyndromMeCP2ECLIA
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1335083
Number of pages
101
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