Title (eng)
Lanostane Triterpenes from Tyrolean Mushrooms
: ASE Based Extraction Protocol, Metabolite Profiling and Isolation
Parallel title (deu)
Lanostan Triterpene von tiroler Pilzen: ASE-basiertes Extraktionsprotokoll, Sekundärmetabolitenprofil und Isolierung
Author
Julia Zwirchmayr
Advisor
Judith M. Rollinger
Co-Advisor
Ulrike Grienke
Assessor
Ulrike Grienke
Abstract (deu)
In dieser Diplomarbeit wurden tetracyclischen Triterpene vom Lanostan-Typ untersucht, die aus verschiedenen in Tirol gesammelten Pilzarten gewonnen wurden. Die folgende Arbeit kann thematisch in zwei Abschnitte gegliedert werden: (i) die Generierung eines Extraktionsprotokolls mit Accelerated Solvent Extraction (ASE) für nichtpolare Triterpene verschiedener Pilzarten für eine anschließende Auftrennung mittels überkritischer Flüssigchromatographie (SFC) und (ii) die Aufreinigung ausgewählter Triterpen- angereicherter Fraktionen von Gloeophyllum odoratum.
Für die Entwicklung des Extraktionsprotokolls mit ASE wurde der Fruchtkörper von Ganoderma lucidum als Modellorganismus für die Vorversuche verwendet, um im Anschluss daran 30 Pilzstämme von 10 verschiedenen Pilzarten im Kleinmaßstab zu extrahieren. Mit dem optimierten Extraktionsverfahren wurde das Sekundärmetabolitenprofil der verschiedenen Stämme jeder Spezies sowohl qualitativ als auch quantitativ verglichen. Dies wurde ermöglicht, da alle Extrakte auf die gleiche Weise erzeugt wurden. In einem weiteren Schritt wurde ein Vergleich des Sekundärmetabolitenprofils der unpolaren Extrakte über SFC-ELSD vorgenommen.
Der zweite Teil dieser Arbeit umfasste die Aufreinigung ausgewählter Triterpen- angereicherter Fraktionen von G. odoratum Stamm 0054. Diese Aufgabe stellte sich als sehr anspruchsvoll heraus, da die zu trennenden Verbindungen hinsichtlich ihrer chemischen Struktur sehr ähnlich waren. Insgesamt wurden fünf verschiedene Fraktionen von G. odoratum - nämlich GO10_01, GO10_02, GO12_04, GO15_01 und GO27_07 - mykochemisch untersucht. Zur Trennung dieser Fraktionen wurde eine semi-präparative UHPLC verwendet, da andere chromatographische Trenntechniken, z.B. SFC, nicht erfolgreich waren. Eine HRMS- und NMR-Analyse dieser Fraktionen zeigte, dass 6 verschiedene Verbindungen enthalten sind: GO36_01 (21-Hydroxylanosterol), GO36_02 (Eburicodiol), GO37_01 (ein neuer Naturstoff), GO37_02 [(15α) -15-Hydroxy-3-oxo- Lanosta-8,24-dien-21-oic acid], GO38_01 (3- Ketodehydrosulfurenic acid) und GO38_02 (Fomefficinic acid D). Von diesen wurden GO36_01 und GO36_02 als Reinsubstanzen isoliert und mit NMR-Strukturaufklärung identifiziert. Die Fraktion GO27_07 erwies sich als Reinsubstanz, die mit einem zuvor im Labor isolierten Inhaltsstoff identisch war, nämlich GO33_03 (Gloeophyllin A). Alle diese Verbindungen wurden noch nie für G. odoratum beschrieben.
Aus früheren Testergebnissen war bekannt, dass der ethanolische Rohextrakt (GO54E) sowie die Dichlormethan-Fraktion (GO54ED) von G. odoratum eine Hemmung des Krebs- relevanten Targets STS und des antiviralen Targets Influenza-NA zeigen. So wurden von den in dieser Arbeit isolierten Reinsubstanzen, sowie anderen bisher isolierte Substanzen [11 Reinsubstanzen (GO54-A bis GO54-O) und einer Mischung (GO54-E)] Lösungen (Stock solutions) in DMSO hergestellt und an Kooperationspartner für die Bioaktivitätstests verschickt. Zusätzlich zu den isolierten Verbindungen wurden auch GO54E und GO54ED auf ihre STS- und NA-Hemmung getestet. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit IR-Spektren und die optische Drehung mehrerer isolierter Reinsubstanzen experimentell ermittelt.
Die STS-Analyse ergab, dass die Hemmung von GO54E höher ist als jene der daraus isolierten Verbindungen und von GO54ED. Dies deutet darauf hin, dass die aktiven Verbindungen in GO54E nicht in GO54ED angereichert sind. Weitere Untersuchungen und Isolierungen aus anderen Fraktionen von GO54E werden derzeit vorgenommen.
Die NA-Analyse ergab vielversprechende Ergebnisse für mehrere Verbindungen aus G. odoratum. Fünf Verbindungen zeigten eine deutliche Aktivität gegen beide Influenza-A Viren IAV HK/68 und IAV Jena/8179, nämlich GO54-A [(3β) -Hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oacid], GO54-E [Mischung aus: (3β) -3-Hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oacid und (3β) -3-Hydroxy-24- methylen-lanost-8-en-21-oacid], GO54-H (Diastereomer von GO54-A) sowie GO54-M (=GO36_01; 21-Hydroxylanosterol) und GO54-N (=GO36_02; Eburicodiol), während GO54-D [(3β, 15α) -Acetyloxy-2,26-dihydroxy- Lanosta-8,24-dien-21-oacid] nur gegen IAV Jena/8179 eine antivirale Aktivität zeigt. Die niedrigste halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) gegen beide Virusstämmen IAV HK/68 (IC50 = 16,72 μM) und IAV Jena/8179 (IC50 = 8,98 μM) wurde für die Zweikomponentenmischung GO54-E ermittelt.
Abstract (eng)
In this diploma thesis the natural compounds of interest are tetracyclic lanostane-type triterpenes derived from various mushroom species collected in Tyrol. The following work can be thematically split into two main sections: (i) the generation of an extraction protocol with Accelerated Solvent Extraction (ASE) for non-polar triterpenes of various mushroom species for a subsequent separation with Supercritical Fluid Chromatography (SFC) and (ii) the purification of selected triterpene-enriched fractions of Gloeophyllum odoratum (Wulffen) Imazeki.
For the generation of the extraction protocol with ASE, the fruit body of Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst was used as a model organism for the preliminary tests and thereafter 10 different mushroom species and more specifically 30 different strains thereof were extracted in small scale with the generated extraction method and, in addition, investigated for their secondary metabolite profile. The point of interest herein was to compare the secondary metabolite profile of the various strains of each species both, qualitatively and quantitatively. This was possible since all extracts were prepared in the exact same way. In a final step, a comparison of the secondary metabolite profiles of the non-polar extracts was achieved via SFC-ELSD.
The second part of this thesis was dedicated to the purification of selected triterpene- enriched fractions of G. odoratum strain 0054. This appeared to be very challenging since the compounds to be separated were very similar regarding their chemical structure. In total, five different fractions of G. odoratum, namely GO10_01, GO10_02, GO12_04, GO15_01 and GO27_07 were mycochemically investigated. For the separation of these fractions, a semi-preparative UHPLC (Ultra High Pressure Liquid Performance) was developed since other chromatographic separation techniques, e.g. SFC, were unsuccessful. NMR- and HRMS investigations of these fractions revealed to contain 6 different compounds: GO36_01 (21-hydroxylanosterol), GO36_02 (eburicodiol), GO37_01 (a new natural compound), GO37_02 [(15α)-15-hydroxy-3-oxo-lanosta-8,24-dien-21-oic acid], GO38_01 (3-ketodehydrosulfurenic acid) and GO38_02 (fomefficinic acid D). Out of these fractions GO36_01 and GO36_02 were isolated as pure compounds and identified by NMR structure elucidation. Fraction GO27_07 turned out to be a single compound identical with a previously isolated pure compound, namely GO33_03 (Gloeophyllin A). All of these compounds have never been identified from G. odoratum before.
From previous test results it was known that the ethanolic crude extract (GO54E) as well as the dichlormethan (DCM) fraction of G. odoratum (GO54ED) shows an inhibition of the cancer related target steroidal sulfatase (STS) and the anti-viral target influenza neuraminidase (NA). Hence, the isolated pure compounds obtained in this work as well as other previously isolated constituents [11 pure compounds (GO54-A to GO54-O) and one mixture (GO54-E)] were prepared as stock solutions (SSo) in DMSO and were sent to collaboration partners for bioactivity testing. In addition GO54E and GO54ED were also tested for their STS and NA inhibition. Furthermore, IR spectra and the optical rotation of several isolated pure compounds were experimentally derived within this thesis.
STS analysis revealed that the inhibition of GO54E is higher than of the isolated compounds or GO54ED, suggesting that the active compounds of GO54E are not enriched in GO54ED. Further investigation and isolation of other fractions of GO54E are ongoing. The results of the NA analysis showed promising results for several compounds of G. odoratum. Five compounds showed activity against both influence A viruses IAV HK/68 and IAV Jena/8179, namely GO54-A [(3β)-Hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oic acid], GO54-E [mixture of: (3β)-3- hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oic acid and (3β)-3-hydroxy-24-methylene-lanost-8-en-21-oic acid], GO54-H (diastereomere of GO54-A) as well as GO54-M (=GO36_01; 21- hydroxylanosterol) and GO54-N (=GO36_02; eburicodiol), whereas GO54-D [(3β,15α)- acetyloxy-2,26-dihydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oic acid] is only active against IAV Jena8179. The lowest half maximal inhibitory concentration (IC50) against both virus strains IAV HK/68 (IC50 = 16,72 μM) and IAV Jena/8179 (IC50 = 8,98 μM) was recorded for the two component mixture GO54-E.
Keywords (eng)
Tyrolean mushroomsAccelerated Solvent ExtractionSupercritical Fluid ChromatographyUltra-High Pressure Liquid Chromatographysteroidsulfatasenoraminidaseinfluenzasecondary metabolite profilingextraction protocolisolationGloeophyllum odoratum
Keywords (deu)
Tiroler PilzeÜberkritische FlüssigchromatographieSteroidsulfataseNoraminidaseInfluenzaSekundärmetaboliten ProfilExtraktionsprotokollIsolierungGloeophyllum odoratum
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Extent (deu)
147 Seiten : Diagramme
Number of pages
157
Study plan
Diplomstudium Pharmazie
[UA]
[449]
Association (deu)
Title (eng)
Lanostane Triterpenes from Tyrolean Mushrooms
: ASE Based Extraction Protocol, Metabolite Profiling and Isolation
Parallel title (deu)
Lanostan Triterpene von tiroler Pilzen: ASE-basiertes Extraktionsprotokoll, Sekundärmetabolitenprofil und Isolierung
Author
Julia Zwirchmayr
Abstract (deu)
In dieser Diplomarbeit wurden tetracyclischen Triterpene vom Lanostan-Typ untersucht, die aus verschiedenen in Tirol gesammelten Pilzarten gewonnen wurden. Die folgende Arbeit kann thematisch in zwei Abschnitte gegliedert werden: (i) die Generierung eines Extraktionsprotokolls mit Accelerated Solvent Extraction (ASE) für nichtpolare Triterpene verschiedener Pilzarten für eine anschließende Auftrennung mittels überkritischer Flüssigchromatographie (SFC) und (ii) die Aufreinigung ausgewählter Triterpen- angereicherter Fraktionen von Gloeophyllum odoratum.
Für die Entwicklung des Extraktionsprotokolls mit ASE wurde der Fruchtkörper von Ganoderma lucidum als Modellorganismus für die Vorversuche verwendet, um im Anschluss daran 30 Pilzstämme von 10 verschiedenen Pilzarten im Kleinmaßstab zu extrahieren. Mit dem optimierten Extraktionsverfahren wurde das Sekundärmetabolitenprofil der verschiedenen Stämme jeder Spezies sowohl qualitativ als auch quantitativ verglichen. Dies wurde ermöglicht, da alle Extrakte auf die gleiche Weise erzeugt wurden. In einem weiteren Schritt wurde ein Vergleich des Sekundärmetabolitenprofils der unpolaren Extrakte über SFC-ELSD vorgenommen.
Der zweite Teil dieser Arbeit umfasste die Aufreinigung ausgewählter Triterpen- angereicherter Fraktionen von G. odoratum Stamm 0054. Diese Aufgabe stellte sich als sehr anspruchsvoll heraus, da die zu trennenden Verbindungen hinsichtlich ihrer chemischen Struktur sehr ähnlich waren. Insgesamt wurden fünf verschiedene Fraktionen von G. odoratum - nämlich GO10_01, GO10_02, GO12_04, GO15_01 und GO27_07 - mykochemisch untersucht. Zur Trennung dieser Fraktionen wurde eine semi-präparative UHPLC verwendet, da andere chromatographische Trenntechniken, z.B. SFC, nicht erfolgreich waren. Eine HRMS- und NMR-Analyse dieser Fraktionen zeigte, dass 6 verschiedene Verbindungen enthalten sind: GO36_01 (21-Hydroxylanosterol), GO36_02 (Eburicodiol), GO37_01 (ein neuer Naturstoff), GO37_02 [(15α) -15-Hydroxy-3-oxo- Lanosta-8,24-dien-21-oic acid], GO38_01 (3- Ketodehydrosulfurenic acid) und GO38_02 (Fomefficinic acid D). Von diesen wurden GO36_01 und GO36_02 als Reinsubstanzen isoliert und mit NMR-Strukturaufklärung identifiziert. Die Fraktion GO27_07 erwies sich als Reinsubstanz, die mit einem zuvor im Labor isolierten Inhaltsstoff identisch war, nämlich GO33_03 (Gloeophyllin A). Alle diese Verbindungen wurden noch nie für G. odoratum beschrieben.
Aus früheren Testergebnissen war bekannt, dass der ethanolische Rohextrakt (GO54E) sowie die Dichlormethan-Fraktion (GO54ED) von G. odoratum eine Hemmung des Krebs- relevanten Targets STS und des antiviralen Targets Influenza-NA zeigen. So wurden von den in dieser Arbeit isolierten Reinsubstanzen, sowie anderen bisher isolierte Substanzen [11 Reinsubstanzen (GO54-A bis GO54-O) und einer Mischung (GO54-E)] Lösungen (Stock solutions) in DMSO hergestellt und an Kooperationspartner für die Bioaktivitätstests verschickt. Zusätzlich zu den isolierten Verbindungen wurden auch GO54E und GO54ED auf ihre STS- und NA-Hemmung getestet. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit IR-Spektren und die optische Drehung mehrerer isolierter Reinsubstanzen experimentell ermittelt.
Die STS-Analyse ergab, dass die Hemmung von GO54E höher ist als jene der daraus isolierten Verbindungen und von GO54ED. Dies deutet darauf hin, dass die aktiven Verbindungen in GO54E nicht in GO54ED angereichert sind. Weitere Untersuchungen und Isolierungen aus anderen Fraktionen von GO54E werden derzeit vorgenommen.
Die NA-Analyse ergab vielversprechende Ergebnisse für mehrere Verbindungen aus G. odoratum. Fünf Verbindungen zeigten eine deutliche Aktivität gegen beide Influenza-A Viren IAV HK/68 und IAV Jena/8179, nämlich GO54-A [(3β) -Hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oacid], GO54-E [Mischung aus: (3β) -3-Hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oacid und (3β) -3-Hydroxy-24- methylen-lanost-8-en-21-oacid], GO54-H (Diastereomer von GO54-A) sowie GO54-M (=GO36_01; 21-Hydroxylanosterol) und GO54-N (=GO36_02; Eburicodiol), während GO54-D [(3β, 15α) -Acetyloxy-2,26-dihydroxy- Lanosta-8,24-dien-21-oacid] nur gegen IAV Jena/8179 eine antivirale Aktivität zeigt. Die niedrigste halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) gegen beide Virusstämmen IAV HK/68 (IC50 = 16,72 μM) und IAV Jena/8179 (IC50 = 8,98 μM) wurde für die Zweikomponentenmischung GO54-E ermittelt.
Abstract (eng)
In this diploma thesis the natural compounds of interest are tetracyclic lanostane-type triterpenes derived from various mushroom species collected in Tyrol. The following work can be thematically split into two main sections: (i) the generation of an extraction protocol with Accelerated Solvent Extraction (ASE) for non-polar triterpenes of various mushroom species for a subsequent separation with Supercritical Fluid Chromatography (SFC) and (ii) the purification of selected triterpene-enriched fractions of Gloeophyllum odoratum (Wulffen) Imazeki.
For the generation of the extraction protocol with ASE, the fruit body of Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst was used as a model organism for the preliminary tests and thereafter 10 different mushroom species and more specifically 30 different strains thereof were extracted in small scale with the generated extraction method and, in addition, investigated for their secondary metabolite profile. The point of interest herein was to compare the secondary metabolite profile of the various strains of each species both, qualitatively and quantitatively. This was possible since all extracts were prepared in the exact same way. In a final step, a comparison of the secondary metabolite profiles of the non-polar extracts was achieved via SFC-ELSD.
The second part of this thesis was dedicated to the purification of selected triterpene- enriched fractions of G. odoratum strain 0054. This appeared to be very challenging since the compounds to be separated were very similar regarding their chemical structure. In total, five different fractions of G. odoratum, namely GO10_01, GO10_02, GO12_04, GO15_01 and GO27_07 were mycochemically investigated. For the separation of these fractions, a semi-preparative UHPLC (Ultra High Pressure Liquid Performance) was developed since other chromatographic separation techniques, e.g. SFC, were unsuccessful. NMR- and HRMS investigations of these fractions revealed to contain 6 different compounds: GO36_01 (21-hydroxylanosterol), GO36_02 (eburicodiol), GO37_01 (a new natural compound), GO37_02 [(15α)-15-hydroxy-3-oxo-lanosta-8,24-dien-21-oic acid], GO38_01 (3-ketodehydrosulfurenic acid) and GO38_02 (fomefficinic acid D). Out of these fractions GO36_01 and GO36_02 were isolated as pure compounds and identified by NMR structure elucidation. Fraction GO27_07 turned out to be a single compound identical with a previously isolated pure compound, namely GO33_03 (Gloeophyllin A). All of these compounds have never been identified from G. odoratum before.
From previous test results it was known that the ethanolic crude extract (GO54E) as well as the dichlormethan (DCM) fraction of G. odoratum (GO54ED) shows an inhibition of the cancer related target steroidal sulfatase (STS) and the anti-viral target influenza neuraminidase (NA). Hence, the isolated pure compounds obtained in this work as well as other previously isolated constituents [11 pure compounds (GO54-A to GO54-O) and one mixture (GO54-E)] were prepared as stock solutions (SSo) in DMSO and were sent to collaboration partners for bioactivity testing. In addition GO54E and GO54ED were also tested for their STS and NA inhibition. Furthermore, IR spectra and the optical rotation of several isolated pure compounds were experimentally derived within this thesis.
STS analysis revealed that the inhibition of GO54E is higher than of the isolated compounds or GO54ED, suggesting that the active compounds of GO54E are not enriched in GO54ED. Further investigation and isolation of other fractions of GO54E are ongoing. The results of the NA analysis showed promising results for several compounds of G. odoratum. Five compounds showed activity against both influence A viruses IAV HK/68 and IAV Jena/8179, namely GO54-A [(3β)-Hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oic acid], GO54-E [mixture of: (3β)-3- hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oic acid and (3β)-3-hydroxy-24-methylene-lanost-8-en-21-oic acid], GO54-H (diastereomere of GO54-A) as well as GO54-M (=GO36_01; 21- hydroxylanosterol) and GO54-N (=GO36_02; eburicodiol), whereas GO54-D [(3β,15α)- acetyloxy-2,26-dihydroxy-lanosta-8,24-dien-21-oic acid] is only active against IAV Jena8179. The lowest half maximal inhibitory concentration (IC50) against both virus strains IAV HK/68 (IC50 = 16,72 μM) and IAV Jena/8179 (IC50 = 8,98 μM) was recorded for the two component mixture GO54-E.
Keywords (eng)
Tyrolean mushroomsAccelerated Solvent ExtractionSupercritical Fluid ChromatographyUltra-High Pressure Liquid Chromatographysteroidsulfatasenoraminidaseinfluenzasecondary metabolite profilingextraction protocolisolationGloeophyllum odoratum
Keywords (deu)
Tiroler PilzeÜberkritische FlüssigchromatographieSteroidsulfataseNoraminidaseInfluenzaSekundärmetaboliten ProfilExtraktionsprotokollIsolierungGloeophyllum odoratum
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Number of pages
157
Association (deu)
License
- Citable links
- Other links
- Managed by
- Details
- Metadata
- Export formats