Abstract (deu)
Die vorliegende Masterarbeit beschäftigt sich insbesondere mit der Forschung von freilebenden Akanthamöben, welche heutzutage als signifikante Erreger schwerwiegende Erkrankungen bei Mensch und Tier hervorrufen können. Hierzu zählen unter anderem Augeninfektionen, Gehirnstörungen sowie Hauterkrankungen. Eine rechtzeitige Diagnose erweist sich aufgrund der spät auftretenden Symptomatik als äußert diffizil. Mittels PCR, Färbemethoden oder durch mikroskopische Untersuchungen kann ein Befall jedoch festgestellt werden. Dem Autor der Arbeit war es ein Bedürfnis die genetische Analyse von krankheitserregenden und nicht-krankheitserregenden Akanthamöben-Stämmen mittels Sequenzierung von Acanthamoeba comandoni Pb30/40, Acanthamoeba lenticulata 72/2 und Acanthamoeba castellanii 1BU zu identifizieren. Mit der Ion Torrent Next Generation Sequencing Technologie, für welche ein Mikrochip verwendet wurde, konnten Kurzsequenzen generiert werden. Das sequenzierte Genom des Stammes 1BU kongruiert zu 62% mit dem Referenzgenom, welches dem selbem Genotyp T4 zuordenbar ist. Bei einem Vergleich ausgewählter Genregionen, die für regulatorische Funktionen des Zytoskeletts relevant sind, wurden nur geringe genetische Abweichungen zum A. castellanii Neff-Referenzstamm sichtbar. Zu den bekannten Virulenzfaktoren zählen vor allem das Mannose-bindende Protein (MBP) sowie Serinproteasen, welche eine Degradierung der Augenmatrix bedingen. Der Sequenzbereich des MBP (1525 bp) weist eine 88 prozentige – und in Bezug auf der Serinprotease – eine 94% Sequenzübereinstimmung zwischen dem pathogenen Stamm 1BU und dem nicht pathogenen Neff-Referenzgenom auf. Die beiden Stämme Pb30/40 (T7)und 72/2 (T5), gehören unterschiedlichen Genotypen an, wodurch lediglich eine geringe Konformität zu dem Referenzstamm besteht. Der Autor generierte im Zuge dieser Studie zwei neue De novo-Assemblierungen für A. comandoni Pb30/40 mit 86,2 Millionen Basenpaaren (GC%: 43,65) und für A. lenticulata 72/2 mit insgesamt 74,7 Millionen Basenpaaren (GC%: 56,91), welche bereits in der Gendatenbank (GenBank) verfügbar sind.
Der zweite Teil dieser Masterarbeit befasst sich mit der Optimierung einer isothermalen DNA-Amplifikation. Hierbei handelt es sich um eine effiziente Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen. Die sogenannte Multiple Strand Displacement Amplifikation (MDA) findet im Vergleich zur klassischen PCR-Reaktion bei konstanter Temperatur statt und garantiert ein zügiges, robustes und effizientes Amplifikationssystem. Die Bst DNA Polymerase (large fragment) disponiert über eine spezielle enzymatische Funktion, die in der Lage ist doppelsträngige DNA aufzutrennen, um eine spezifische Primerbindung zu konstituieren. Die Optimierung der Primerspezifität sowie der Amplifikation wurde in verschiedenen Experimenten getestet. Hierzu zählen unter anderem die Verwendung von A) Dimethylsulfoxid (DMSO), B) interkalierenden DNA Klammern, C) eines Restriktionsverdaus von bakterieller gDNA, und D) universellen Primern. Die Zugabe von 0,5% DMSO zu einer 20µl Reaktion bei einer Temperatur von 65°C erwies sich als ausreichend, um eine Verbesserung der Primerbindung zu dokumentieren. Die Verwendung von speziellen DNA Strukturen (DNA Klammern) in einer MDA steigerte die Bindung der Primer an ausgewählte Genregionen von Extended Spectrum β-Lactamasen. Die isothermale DNA-Amplifikation wurde mit fluoreszierenden Sonden (Molecular Beacons) mittels qPCR nachgewiesen. Zudem wurden falsch-positive MDA Ergebnisse sowie negative Kontrollen mittels Sequenzierung analysiert, um unspezifische Amplifikationsprodukte ausschließen zu können.