Title (eng)
In vitro evaluation of polycationic gene delivery systems on EGFR expressing cancer cell lines
Parallel title (deu)
In vitro Evaluierung polykationischer Gene-delivery Systeme an EGFR exprimierenden Krebszelllinien
Author
Martina Joncic
Advisor
Manfred Ogris
Co-Advisor
Haider Sami
Assessor
Manfred Ogris
Abstract (deu)
Aufgrund von zahlreichen unerwünschten Nebenwirkungen oder zu geringer Selektivität der Wirkstoffe bei konventionellen Krebstherapiebehandlungen, wurde in den letzten Jahren nach Alternativen geforscht. Vor allem im Bereich der Gentherapie konnten erfolgreiche Fortschritte gemacht werden.
Im Allgemeinen können Vektoren für den Gentransfer in zwei Gruppen, virale und die nicht – virale, eingeteilt werden. Im Zuge der Diplomarbeit fokussierten wir uns auf nicht – virale Vektoren basierend auf linearem Polyethylenimin (LPEI) und LPEI – PEG – Peptidkonjugaten für EGFR – mediierte Transfektionen (EGFR: Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor). Mittels LPEI – Plasmid DNA (pDNA) Komplexen, sogenannte Polyplexe, kann genetisches Material (z.B. pDNA) zielgerichtet in Zellen gebracht werden.
Ein besonderer Fokus der Arbeit lag auf der Austestung von Peptid Konjugaten mit den Peptiden GE11 und CLARLLT. Eine wichtige Eigenschaft dieser zwei Peptid- Konjugate ist es, dass sie an den EGFR binden ohne diesen zu aktivieren. Die biologische Evaluierung dieser Transfersysteme erfolgte an zwei humanen (A549.wt and LS174T.wt) und einer murinen (CT26.wt) EGFR – überexprimierenden Krebszelllinien. Die Qualität der generierten Partikel wurde mittels nanoparticle tracking analysis (NTA) ausgetestet.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurden Toxizität (verschiedene ng/well) und Transfektionseffizienz (N/P ratio 6 oder 9) von Polyplexen mit LPEI (Molekulargewicht 10kDa getestet) und eine Optimierung des Transfektionsassays durchgeführt.
Im zweiten Teil meiner Diplomarbeit wurden EGFR – Targetingassays in 96 – Well Platten durchgeführt, wobei der Fokus auf CLARLLT als Targetingkomponente von LPEI –basierten Polyplexen lag. Mit unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass LPEI – PEG – CLARLLT eine höhere Transfektionseffizienz als LPEI – PEG – GE11 in A549.wt und CT26.wt Zellen besitzt.
Weiters, haben wir bewiesen, dass CLARLLT auch für das EGFR-Targeting in murinen Krebszelllinien geeignet ist.
Im letzten Teil meiner Arbeit wurde ein Protokoll für die Zell – Fixation erstellt und die zelluläre Aufnahme von Polyplexen konnte erfolgreich an A549.wt Krebszellen mittels Konfokalmikroskop gezeigt werden.
Abstract (eng)
A lot of alternatives to conventional therapies for cancer have been researched in recent years because of many undesired side effects or not enough specificity of used agents. Especially in the field of gene therapy successful improvements have been made.
Generally, gene delivery vectors can be divided into two groups, namely viral and non – viral vectors. In this work, we focused on non – viral gene delivery based on linear Polyethylenimine (LPEI) and LPEI-PEG-Peptide conjugates for Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) – mediated transfections. LPEI – plasmid DNA (pDNA) complexes, so-called polyplexes, can be used to deliver genetic material (e.g. pDNA) into cells.
In particular, we focused on testing of the peptide-PEG-LPEI conjugates with GE11 – and CLARLLT – peptide. An important feature of these two peptide – conjugates is that they bind to EGFR without receptor activation.
Biological evaluation of these gene delivery systems was performed on human (A549.wt and LS174T.wt) and murine (CT26.wt) EGFR – overexpressing cancer cell lines. Quality check of generated polyplexes was done by nanoparticle tracking analysis (NTA).
In the first part of the work, toxicity (various ng/well) and transfection efficiency (N/P ratio 6 or 9) of LPEI with Mw (weight average molecular weight) of 10,000 Da was tested and optimization of transfection assay was done.
In the second part EGFR targeting assays were performed in 96 – well plate format, focusing on CLARLLT as targeting component of LPEI based polyplexes. It could be shows that LPEI – PEG – CLARLLT polyplexes had a higher transfection efficiency than LPEI – PEG – GE11 in A549.wt and CT26. wt. This demonstrated that CLARLLT peptide can also be used for targeting the murine EGFR.
In the last part of the work, a cell fixation protocol was established and the cellular uptake was successfully visualized via Confocal Microscopy on A549.wt cells.
Keywords (eng)
EGFRpolycationicgene deliverycancercancer cell linesin vitroLPEICLARLLTnon-viral
Keywords (deu)
EGFRpolykationischGene-deliveryKrebsKrebszelllinienin vitroLPEICLARLLTnicht-viral
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1338944
rdau:P60550 (deu)
78 Seiten : Diagramme
Number of pages
78
Study plan
Diplomstudium Pharmazie
[UA]
[449]
Association (deu)
Title (eng)
In vitro evaluation of polycationic gene delivery systems on EGFR expressing cancer cell lines
Parallel title (deu)
In vitro Evaluierung polykationischer Gene-delivery Systeme an EGFR exprimierenden Krebszelllinien
Author
Martina Joncic
Abstract (deu)
Aufgrund von zahlreichen unerwünschten Nebenwirkungen oder zu geringer Selektivität der Wirkstoffe bei konventionellen Krebstherapiebehandlungen, wurde in den letzten Jahren nach Alternativen geforscht. Vor allem im Bereich der Gentherapie konnten erfolgreiche Fortschritte gemacht werden.
Im Allgemeinen können Vektoren für den Gentransfer in zwei Gruppen, virale und die nicht – virale, eingeteilt werden. Im Zuge der Diplomarbeit fokussierten wir uns auf nicht – virale Vektoren basierend auf linearem Polyethylenimin (LPEI) und LPEI – PEG – Peptidkonjugaten für EGFR – mediierte Transfektionen (EGFR: Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor). Mittels LPEI – Plasmid DNA (pDNA) Komplexen, sogenannte Polyplexe, kann genetisches Material (z.B. pDNA) zielgerichtet in Zellen gebracht werden.
Ein besonderer Fokus der Arbeit lag auf der Austestung von Peptid Konjugaten mit den Peptiden GE11 und CLARLLT. Eine wichtige Eigenschaft dieser zwei Peptid- Konjugate ist es, dass sie an den EGFR binden ohne diesen zu aktivieren. Die biologische Evaluierung dieser Transfersysteme erfolgte an zwei humanen (A549.wt and LS174T.wt) und einer murinen (CT26.wt) EGFR – überexprimierenden Krebszelllinien. Die Qualität der generierten Partikel wurde mittels nanoparticle tracking analysis (NTA) ausgetestet.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurden Toxizität (verschiedene ng/well) und Transfektionseffizienz (N/P ratio 6 oder 9) von Polyplexen mit LPEI (Molekulargewicht 10kDa getestet) und eine Optimierung des Transfektionsassays durchgeführt.
Im zweiten Teil meiner Diplomarbeit wurden EGFR – Targetingassays in 96 – Well Platten durchgeführt, wobei der Fokus auf CLARLLT als Targetingkomponente von LPEI –basierten Polyplexen lag. Mit unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass LPEI – PEG – CLARLLT eine höhere Transfektionseffizienz als LPEI – PEG – GE11 in A549.wt und CT26.wt Zellen besitzt.
Weiters, haben wir bewiesen, dass CLARLLT auch für das EGFR-Targeting in murinen Krebszelllinien geeignet ist.
Im letzten Teil meiner Arbeit wurde ein Protokoll für die Zell – Fixation erstellt und die zelluläre Aufnahme von Polyplexen konnte erfolgreich an A549.wt Krebszellen mittels Konfokalmikroskop gezeigt werden.
Abstract (eng)
A lot of alternatives to conventional therapies for cancer have been researched in recent years because of many undesired side effects or not enough specificity of used agents. Especially in the field of gene therapy successful improvements have been made.
Generally, gene delivery vectors can be divided into two groups, namely viral and non – viral vectors. In this work, we focused on non – viral gene delivery based on linear Polyethylenimine (LPEI) and LPEI-PEG-Peptide conjugates for Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) – mediated transfections. LPEI – plasmid DNA (pDNA) complexes, so-called polyplexes, can be used to deliver genetic material (e.g. pDNA) into cells.
In particular, we focused on testing of the peptide-PEG-LPEI conjugates with GE11 – and CLARLLT – peptide. An important feature of these two peptide – conjugates is that they bind to EGFR without receptor activation.
Biological evaluation of these gene delivery systems was performed on human (A549.wt and LS174T.wt) and murine (CT26.wt) EGFR – overexpressing cancer cell lines. Quality check of generated polyplexes was done by nanoparticle tracking analysis (NTA).
In the first part of the work, toxicity (various ng/well) and transfection efficiency (N/P ratio 6 or 9) of LPEI with Mw (weight average molecular weight) of 10,000 Da was tested and optimization of transfection assay was done.
In the second part EGFR targeting assays were performed in 96 – well plate format, focusing on CLARLLT as targeting component of LPEI based polyplexes. It could be shows that LPEI – PEG – CLARLLT polyplexes had a higher transfection efficiency than LPEI – PEG – GE11 in A549.wt and CT26. wt. This demonstrated that CLARLLT peptide can also be used for targeting the murine EGFR.
In the last part of the work, a cell fixation protocol was established and the cellular uptake was successfully visualized via Confocal Microscopy on A549.wt cells.
Keywords (eng)
EGFRpolycationicgene deliverycancercancer cell linesin vitroLPEICLARLLTnon-viral
Keywords (deu)
EGFRpolykationischGene-deliveryKrebsKrebszelllinienin vitroLPEICLARLLTnicht-viral
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1338945
Number of pages
78
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