Influence of genetic engineering on genetics, epigenetics, and transcriptomics of Zea mays

Sina-Elisabeth Ben Ali

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1345849

Title (eng)

Parallel title (deu)

Einfluß von Gentechnik auf die Genetik, Epigenetik und das Transkriptom von Zea Mays

Author

Sina-Elisabeth Ben Ali

Advisor

Alexander Haslberger

Assessor

Yves Bertheau

Kaare Magne Nielsen

Abstract (deu)

Der Anbau von gentechnisch veränderten (GV) Pflanzen, vor allem von sogenannten „Stacked Events“ (enthalten mindestens 2 Transgene), nimmt weltweit stark zu. Rekombinante DNA-Techniken, wie die Gentechnik, sind in der Pflanzenzüchtung sehr verbreitet. Gentechnische Veränderungen können, genauso wie andere Züchtungstechniken, zu unbeabsichtigten Effekten in der Pflanze führen. Die Durchführung angemessener Risikobewertungen ist ein sehr wichtiges Thema um die biologische Sicherheit zu gewährleisten. Seit der ersten Freisetzung von GV-Pflanzen wurden mehrere neue molekularbiologische Methoden, wie Next Generation Sequencing, entwickelt. Diese Methoden ermöglichen die Bereitstellung neuer wissenschaftlicher Informationen für Risikobewertungen von GV-Pflanzen. Wir nutzten diese vielversprechende Methode, neben anderen geeigneten molekularbiologischen Methoden, um die Genetik, Epigenetik und das Transkriptom von häufig vermarkteten GV-Maissorten näher zu erforschen. Insektenresistenter und herbizidresistenter Mais wurde auf verschiedenen molekularen Ebenen untersucht. Im Rahmen der Dissertation haben wir die genetische Stabilität von transgenen Inserts und deren flankierenden Regionen getestet, was ein essentielles Sicherheitskriterium für die Zulassung von GV-Pflanzen in der EU darstellt. Die 3'-flankierende Region von insektenresistentem Mais wurde in Samen von vier verschiedenen MON810-Maissorten, zwei „Stacked Events“ und zwei „Single Events“, untersucht. Die analysierte Region umfasste einen Teil der cry1ab-codierenden Region und den Übergang vom MON810-Transgen zum natürlichen Maisgenom. Interessanterweise zeigte die DNA-Sequenzierung einige genetische Varianten im rekombinanten cry1ab-Gen. Die analysierten „Stacked Events“ enthielten deutlich mehr Varianten sowie deutlich höhere Frequenzen der Varianten als die analysierten „Single Events“. Da Mutations-Hotspots auch durch die pro-mutagenen Aktivitäten von Cytosin-Modifikationen wie Methylierung, Desaminierung und Halogenierung entstehen können, haben wir Cytosin-Methylierungsmuster in der kodierenden Region untersucht. Der gemessene Methylierungsstatus war jedoch in allen getesteten Sorten sehr niedrig. Daher war eine Verbindung mit dem Mutations-Hotspot unwahrscheinlich. Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede im Methylierungsstatus bei den getesteten Sorten oder zwischen Proben mit oder ohne Mutations-Hotspot festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die partielle Instabilität des cry1ab-Locus höchstwahrscheinlich nicht vom Cytosin-Methylierungsstatus beeinflusst wird. Des Weiteren wurde auch herbizidresistenter Mais auf genetische Stabilität untersucht. Zwei „stacked“ NK603-Maissorten wurden auf Mutationen im NK603-Transgen und seinen flankierenden Regionen gescreent. Wir fanden interessanterweise zwei Nukleotide im Reis-Actin-1-Promotor in allen sequenzierten Proben, die im veröffentlichten NK603-Patent nicht vorhanden waren. Darüber hinaus waren diese zusätzlichen Nukleotide auch in zertifiziertem NK603-Referenzmaterial vorhanden. Diese Ergebnisse deuten auf einen Sequenzierungsfehler oder einen manuellen Kopier-/Einfügefehler der Firma hin, die die Patentsequenz bestimmte. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die identifizierten Insertionen während der Pflanzenzüchtung entstanden sind. Im Rahmen der Dissertation wurden auch mögliche unbeabsichtigte Wirkungen des kommerziellen NK603-Transgens auf Transkriptom-Ebene untersucht. Hierfür wurden Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und RT-qPCR angewandt. Der beim Sequenzieren erhaltenen Nukleotidabfolge konnten mehr als 30.000 Maisgenen zugeordnet werden. Transkriptom-Profile von NK603-Mais und der Vergleichsmaissorte wurden verglichen und eine differentielle Genexpressionsanalyse identifizierte 286 unterschiedlich exprimierte Gene. Eine Singular Enrichment Analyse (SEA) wurde mit den 286 unterschiedlich regulierten Genen durchgeführt, um signifikant überrepräsentierte Genfunktionen herauszufiltern. Die SEA zeigte, dass insbesondere die Reaktion auf verschiedene Stimuli, Stressreaktionen, Signalwege und Stoffwechselprozesse unter den 286 Genen signifikant überrepräsentiert sind. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Transkriptom-Profile von GM-Pflanzen sich signifikant von ihren nahezu isogenen Vergleichspflanzen unterscheiden können. Ob die 286 unterschiedlich exprimierten Gene hauptsächlich aufgrund des NK603-Transgens oder eher aufgrund externer Faktoren (wie Temperatur oder landwirtschaftliche Praxis) verändert sind, muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Die im Rahmen dieses Promotionsvorhabens durchgeführten Studien befassten sich mit verschiedenen Fragen der biologischen Sicherheit von GV-Pflanzen. Die Ergebnisse liefern wertvolle Informationen für die Risikobewertung von GV-Pflanzen und Pflanzenzüchtungsunternehmen. Angesichts der rasanten Entwicklung der Biotechnologiebranche sind die Ergebnisse von großer Bedeutung. Darüber hinaus können die Ansätze zur Charakterisierung von GV-Pflanzen auch für die Untersuchung von Pflanzen genutzt werden, die durch neue Pflanzenzüchtungstechniken erzeugt werden und die in Zukunft eine entscheidende Rolle in der Landwirtschaft spielen werden.

Abstract (eng)

The cultivation of genetically modified (GM) plants, especially stacked events (containing at least two transgenes), is substantially increasing worldwide. Recombinant DNA techniques, such as genetic engineering, are very common in plant breeding. Genetic engineering can, like other breeding techniques, lead to unintended effects in the plant. The performance of adequate risk assessments is a very important issue to ensure biosafety. Since the first release of GM plants, several new molecular biology methods, such as next generation sequencing, were developed. These methods have the ability to provide new scientific information for GM plant risk assessments. In the era of next generation sequencing, we used this powerful tool, in addition to other appropriate molecular biology methods, to provide a deeper inside into the genetics, epigenetics, and transcriptomics of frequently marketed GM maize varieties. Insect-resistant and herbicide-resistant maize was investigated on different molecular levels. We tested the genetic stability of transgenic inserts and their flanking regions, which is an essential safety criterion for the admission of GM plants in the EU. The 3´flanking region of insect-resistant maize was studied in seeds of four different MON810 maize varieties, two stacked event varieties and two single event varieties. The analyzed region included a part of the cry1ab coding region and the transition from the MON810 transgene to the genomic maize domain. Interestingly, DNA sequencing revealed some genetic variants in the recombinant cry1ab gene. The analyzed stacked events harbored markedly more variants as well as markedly higher frequencies of the variants than the analyzed single events. Since mutational hotspots can also arise through the pro-mutagenic activities of cytosine modifications such as methylation, deamination, and halogenation, we analyzed cytosine methylation patterns in the coding region. The observed methylation status was very low in all tested varieties. Therefore, a connection with the mutational hotspot was unlikely. Moreover, no significant differences were identified in the methylation status among the tested varieties or between samples with or without the mutational hotspot. These results indicate that the partial instability of the cry1ab locus is most likely not influenced by the cytosine methylation status. We also studied herbicide-resistant maize for its genetic stability. Two stacked NK603 maize varieties were screened for mutations in the NK603 transgene and its flanking regions. Interestingly, we found two nucleotides in all sequenced samples in the rice actin 1 promoter, which were not present in the published NK603 patent. Moreover, these additional nucleotides were also present in certified NK603 reference material. These results indicated a sequencing error or a manual copy/paste error of the company that determined the patent sequence. However, it cannot be excluded that the identified insertions were introduced during crop breeding. Furthermore, possible unintended effects of the commercial NK603 transgene were studied on transcriptomic level using high-throughput RNA sequencing and RT-qPCR. Mapped reads corresponded to more than 30,000 unigenes. Transcriptome profiles of NK603 maize and near-isogenic maize were compared and differential gene expression analysis revealed 286 differentially expressed genes. Singular enrichment analysis (SEA) with the 286 differentially regulated genes was performed to filter out significantly overrepresented gene functions. SEA revealed that especially response to different stimuli, stress response, signaling pathways, and metabolic processes were significantly overrepresented among the 286 genes. The results of this study show that the transcriptomic profiles of GM plants can be significantly different from their near-isogenic non-GM comparators. Whether the 286 differentially expressed genes are mainly modified due to the NK603 transgene or more due to external factors (such as temperature or farming practice) needs to be elucidated in further experiments. The studies performed in the frame of this PhD project addressed different biosafety issues of GM plants. The results provide valuable information for GM plant risk assessment and plant breeding companies. Given the rapid development of the biotechnology industry, the results are of vehement importance. Moreover, the approaches used for the characterization of GM plants can also be applied for the investigation of plants produced by new plant breeding techniques, which will play a crucial role in the future of agriculture.

Keywords (eng)

genetic engineeringgenetically modified organismsfood safetyGMObiosafetygeneticsepigeneticstranscriptomicsnext generation sequencing

Keywords (deu)

Gentechnikgenetisch veränderte OrganismenLebensmittelsicherheitGVOBiosicherheitGenetikEpigenetikTranskriptomSequenzierung

Subject (deu)

Subject (deu)

Subject (deu)

Type (deu)