Title (eng)
Purification and characterization of a potential therapeutic protein for spinal muscular atrophy
Parallel title (deu)
Aufreinigung und Charakterisierung eines potentiellen therapeutischen Proteins für die spinale Muskelatrophie
Author
Zsófia Kormányos
Advisor
Franco Laccone
Assessor
Franco Laccone
Abstract (deu)
Spinale Muskelatrophie (SMA) ist die zweithäufigste autosomal-rezessive genetische Erkrankung. SMA ist die führende genetische Ursache für den Tod von Säuglingen, die durch Degeneration von Motoneuronen, Skelettmuskelatrophie und allgemeine Schwäche gekennzeichnet ist. Die Krankheit wird durch eine homozygote Störung im SMN1-Gen verursacht, die zu niedrigen Spiegeln des SMN1-Proteins führt. Wir haben ein Fusionsprotein namens TAT-SMN1 entwickelt. TAT (Transactivator der Transkription) ist ein zellpenetrierendes Peptid. Wir reinigten TAT-SMN1 aus Einschlusskörpern auf verschiedene Arten und untersuchten die Transduktion dieser Proteine in Motoneuron-ähnliche Zellen. Unsere Ergebnisse waren nicht schlüssig, da das gereinigte Protein aggregierte. Es gelang uns nicht, lösliches Protein zu exprimieren, obwohl wir eine niedrige Expressionstemperatur, verschiedene Bakterienstämme, Coexpression mit Chaperonen, ergänzende Zusätze zu den Expressionsmedien und deren Kombination versucht hatten. Denaturierende Lyseverfahren könnten das Protein solubilisieren, aber auch milde Lyseverfahren, was bedeutet, dass TAT-SMN1 in nicht-klassische Einschlusskörper exprimiert wird. Selbst mit der milden Lysemethode mussten wir das Protein zurückfalten und die Aggregation trat an diesem Punkt auf. Wir haben viele verschiedene Techniken für Rückfaltung und Zusatzstoffe im Speicherpuffer ausprobiert. Wir fanden, dass der beste Lagerungspuffer zur Unterdrückung der Aggregation im Falle der denaturierenden Reinigung TCEP war und mit den milden Lyseverfahren der Standardlagerungspuffer ohne Additive, jedoch aggregierte das Protein immer noch in einem signifikanten Ausmaß. Das Hauptaugenmerk für die Zukunft liegt auf der Reinigung von stabilem, löslichem und nicht-aggregierendem TAT-SMN1 in hoher Reinheit und vernünftiger Konzentration.
Abstract (eng)
Spinal muscular atrophy (SMA) is the second most common autosomal recessive genetic disorder. SMA is the leading genetic cause of infant death characterized by degeneration of motor neurons, skeletal muscle atrophy and general weakness. The disease is caused by a homozygous disruption in the SMN1 gene which results in low levels of the SMN1 protein. We developed a fusion protein called TAT-SMN1. TAT (transac-tivator of transcription) is a cell penetrating peptide. We purified TAT-SMN1 from inclusion bodies in various ways and examined the transduction of these proteins into motor neuron-like cells. Our results were not conclusive because the purified protein was aggregating. We did not manage to express soluble protein even though we had attempted low expression temperature, different bacteria strains, coexpressing it with chaperons, supplementing additives to the expression media and the combination of these. Denaturing lysis methods could solubilize the protein but, so could mild lysis methods, meaning TAT-SMN1 is expressed into non-classical inclusion bodies. Even with the mild lysis method we needed to refold the protein and aggregation occurred at this point. We tried many different techniques for refolding and additives in the storage buffer. We found that the best storage buffer for supressing the aggregation in case of denaturing purification was TCEP and with the mild lysis methods the standard storage buffer without additives, however the protein was still aggregating to a significant extent. The main focus for the future is to purify stable, soluble and non-aggregating TAT-SMN1 to high purity and reasonable concentration.
Keywords (eng)
spinal muscular atrophyTAT fusion proteintransductionprotein expressionprotein purificationprotein aggregation
Keywords (deu)
Spinale MuskelatrophieTAT-FusionsproteinTransduktionProteinexpressionProteinreinigungProteinaggregation
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1347804
rdau:P60550 (deu)
70 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
70
Association (deu)
Title (eng)
Purification and characterization of a potential therapeutic protein for spinal muscular atrophy
Parallel title (deu)
Aufreinigung und Charakterisierung eines potentiellen therapeutischen Proteins für die spinale Muskelatrophie
Author
Zsófia Kormányos
Abstract (deu)
Spinale Muskelatrophie (SMA) ist die zweithäufigste autosomal-rezessive genetische Erkrankung. SMA ist die führende genetische Ursache für den Tod von Säuglingen, die durch Degeneration von Motoneuronen, Skelettmuskelatrophie und allgemeine Schwäche gekennzeichnet ist. Die Krankheit wird durch eine homozygote Störung im SMN1-Gen verursacht, die zu niedrigen Spiegeln des SMN1-Proteins führt. Wir haben ein Fusionsprotein namens TAT-SMN1 entwickelt. TAT (Transactivator der Transkription) ist ein zellpenetrierendes Peptid. Wir reinigten TAT-SMN1 aus Einschlusskörpern auf verschiedene Arten und untersuchten die Transduktion dieser Proteine in Motoneuron-ähnliche Zellen. Unsere Ergebnisse waren nicht schlüssig, da das gereinigte Protein aggregierte. Es gelang uns nicht, lösliches Protein zu exprimieren, obwohl wir eine niedrige Expressionstemperatur, verschiedene Bakterienstämme, Coexpression mit Chaperonen, ergänzende Zusätze zu den Expressionsmedien und deren Kombination versucht hatten. Denaturierende Lyseverfahren könnten das Protein solubilisieren, aber auch milde Lyseverfahren, was bedeutet, dass TAT-SMN1 in nicht-klassische Einschlusskörper exprimiert wird. Selbst mit der milden Lysemethode mussten wir das Protein zurückfalten und die Aggregation trat an diesem Punkt auf. Wir haben viele verschiedene Techniken für Rückfaltung und Zusatzstoffe im Speicherpuffer ausprobiert. Wir fanden, dass der beste Lagerungspuffer zur Unterdrückung der Aggregation im Falle der denaturierenden Reinigung TCEP war und mit den milden Lyseverfahren der Standardlagerungspuffer ohne Additive, jedoch aggregierte das Protein immer noch in einem signifikanten Ausmaß. Das Hauptaugenmerk für die Zukunft liegt auf der Reinigung von stabilem, löslichem und nicht-aggregierendem TAT-SMN1 in hoher Reinheit und vernünftiger Konzentration.
Abstract (eng)
Spinal muscular atrophy (SMA) is the second most common autosomal recessive genetic disorder. SMA is the leading genetic cause of infant death characterized by degeneration of motor neurons, skeletal muscle atrophy and general weakness. The disease is caused by a homozygous disruption in the SMN1 gene which results in low levels of the SMN1 protein. We developed a fusion protein called TAT-SMN1. TAT (transac-tivator of transcription) is a cell penetrating peptide. We purified TAT-SMN1 from inclusion bodies in various ways and examined the transduction of these proteins into motor neuron-like cells. Our results were not conclusive because the purified protein was aggregating. We did not manage to express soluble protein even though we had attempted low expression temperature, different bacteria strains, coexpressing it with chaperons, supplementing additives to the expression media and the combination of these. Denaturing lysis methods could solubilize the protein but, so could mild lysis methods, meaning TAT-SMN1 is expressed into non-classical inclusion bodies. Even with the mild lysis method we needed to refold the protein and aggregation occurred at this point. We tried many different techniques for refolding and additives in the storage buffer. We found that the best storage buffer for supressing the aggregation in case of denaturing purification was TCEP and with the mild lysis methods the standard storage buffer without additives, however the protein was still aggregating to a significant extent. The main focus for the future is to purify stable, soluble and non-aggregating TAT-SMN1 to high purity and reasonable concentration.
Keywords (eng)
spinal muscular atrophyTAT fusion proteintransductionprotein expressionprotein purificationprotein aggregation
Keywords (deu)
Spinale MuskelatrophieTAT-FusionsproteinTransduktionProteinexpressionProteinreinigungProteinaggregation
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1347805
Number of pages
70
Association (deu)
License
Citable links
Other links
Managed by
Details
Metadata
Export formats
Universitätsring 1, 1010 Wien | T
T +43-1-4277-0