Höhere eukaryotische Organismen bestehen aus einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen. All diese Zelltypen besitzen die gleiche Erbinformation und entstehen während der Embryonalentwicklung aus einer einzigen Zelle. Eine der interessantesten Fragen der Biologie zur Zeit ist, wie es möglich ist, dass eine so große Komplexität zustande kommen kann, obwohl jede Zelle das gleiche Genom innewohnt. Dies wird zu einem großen Teil durch die transkriptionelle Regulation von Genen erreicht. Enhancer sind cis-regulatorische Sequenzen die die korrekte zeitliche und räumliche Expression von Genen sicherstellen. Transkriptionsfaktoren binden an kurze Sequenzmotive im Enhancer und lesen somit die regulatorische Information die dort kodiert ist. Transkriptionsfaktoren sind essenziell für Enhancer Funktion. Mutiert man die Bindestellen für einen Transkriptionsfaktor in einem Enhancer so ist dieser nicht mehr in der Lage seine regulatorischen Funktionen korrekt auszuführen. Umgekehrt verliert der Enhancer auch seine Aktivität wenn der Transkriptionsfaktor nicht vorhanden ist. Dies deutet darauf hin, dass einzelne Transkriptionsfaktoren nicht ausreichend sind um einen Enhancer zu aktivieren, sondern dass ein Kollektiv von Transkritionsfaktoren zusammenkommen muss um die korrekte Aktivität sicherzustellen. In dieser Arbeit beschreiben wir einen Assay der es uns erlaubt mehrere Transkriptionsfaktoren an einen transkriptionellen Reporter zu rekrutieren, indem diese an verschiedene DNA Bindedomänen fusioniert warden die an distinkte DNASequenzen binden. Damit ist es uns möglich deren cooperative Aktivität zu untersuchen. Wir verwendeten kontext-spezifische Transkriptionsfaktoren um gezielt nach deren Partnerfaktoren zu suchen. Wir testeten 476 Drosophila melanogaster Transkriptionsfaktoren und fanden 42 cooperative Paare. Diese Paare bestätigten sich in zwei Kontrollexperimenten. Keines dieser Paare ist jedoch ausreichend für transkriptionelle Aktivierung wenn man sie aus dem Enhancer Kontext heraußnimmt, und in einem synthetischen Kontext rekrutieret der nur die Erkennungssequenzen der DNA Bindedomänen enthält. Aus diesem Grund testeten wir Tripletts von Transkriptionsfaktoren, sowohl in einem Enhnacer Kontext als auch im synthetischen Kontext, und fanden cooperative Transkriptionsfaktoren in beiden Experimenten. Die 5 Kooperativität der Transkriptionsfaktoren wurde verstärkt wenn wir die natürliche Anordnung der Motive beibehielten.

The temporal and spatial expression of genes is regulated by transcription factors (TFs) that bind to enhancer regions in a combinatorial fashion. Even though we know the identity of many TFs and the genes they regulate, it is unclear how exactly TFs control enhancer activity and gene transcription. Here we probe the functional interdependencies of TFs and determine combinations of TFs that show synergistic activation. We co-recruit defined sets of TFs via different DNA-binding-domains (DBDs) to different positions within enhancer contexts. This multi-dimensional enhancer complementation assay revealed obligate combinatorial TFs and enabled the definition of pairs of TFs that strongly activate transcription when co-bound, even though each TF alone is inactive. Furthermore, we demonstrate that, even though both partner TFs are necessary for transcriptional activation, these cooperative TF pairs are not sufficient to reconstitute enhancer activity when co-recruited outside enhancer contexts. In contrast, enhancer function and reporter transcription can be achieved by recruiting three TFs simultaneously and is enhanced when they are recruited in an arrangement that reflects the binding site arrangement of an endogenous enhancer. The demonstration that TFs control transcription via combinations of (biochemically) distinct regulatory functions has important implications for our understanding of combinatorial enhancer control and gene expression (Reiter et al., 2016).