Title (eng)
Investigating the properties of PET-hydrolase and PBS-depolymerase
Parallel title (deu)
Untersuchung der Eigenschaften von PET-hydrolase und PBS-depolymerase
Author
Christoph Hinterberger
Advisor
Udo Bläsi
Assessor
Udo Bläsi
Abstract (deu)
Der Stamm SHuffle T7 Express war als einziger in der Lage, lösliche PBSase zu produzieren, wenn auch in sehr geringen Mengen. E. coli BL21(DE3) war wahrscheinlich in der Lage PelB-PBSase zu synthetisieren, aber der Großteil des Enzyms war weder im löslichen, noch im unlöslichen Teil des Zelllysates zu finden. Es ist empfehlenswert in zukünftigen Experimenten das Expressionsmedium eines solchen Stammes auf den Verbleib der PBSase zu untersuchen.
Das Signalpeptid der PBSase hat wahrscheinlich einen verzögerten, aber letalen Effekt auf E. coli, unabhängig ob die Zellen bei 4°C gelagert werden, oder bei 16°C weiter wachsen.
PBSase hat einen Schmelzpunkt bei etwa 38°C und ist damit um etwa 6-10°C weniger thermostabil als PETase. Die katalytische Aktivität der PBSase gegen pNPA und PET konnte nicht genau bestimmt werden, erscheint aber um einige Grade schwächer als die Aktivität der PETase. Eine turbidimetrische Analyse zeigte eine starke Aktivität von PBSase gegen PET-nanopartikel.
Unter Verwendung des Stammes Shuffle T7 Express konnte PETase als lösliches und funktionelles Enzym produziert werden, und zeigte eine starke Aktivität gegen PET-nanopartikel. Die spezifische Aktivität gegen 1mM pNPA wurde errechnet und betrug 18.2 U/mg. Dieser Wert kann noch durch weitere Aufreinigung erhöht werden. Thermostabilität wurde gemessen mittels NanoDSF und die gemessene Schmelztemperatur betrug 44.7°C, was um 2-4°C weniger ist als die Schmelzpunkte, die von anderen Gruppen gemessen wurden (Austin et al., 2018; Joo et al., 2018). Dieser leicht niedrigere Schmelzpunkt könnte durch die Verwendung von Shuffle T7 Express als Expressionsstamm zustande gekommen sein.
Die turbidimetrische Analyse unter Verwendung von PET-nanopartikeln, die aus amorpher PET-folie hergestellt wurden, wurde mit dem Einsatz von verschiedenen Konzentrationen von PETase demonstriert.
Abstract (eng)
Only SHuffle T7 Express was able to produce soluble PBSase, albeit in very low quantities. E. coli BL21(DE3) was likely able to produce pelB-PBSase, but the bulk of the enzyme, soluble or insoluble, could not be found when analyzing cell lysates. In future experiments, the expression media of such cultures should be investigated for the presence of PBSase.
The signal peptide of PBSase likely has a delayed, lethal effect on E. coli, stored at 4°C, or growing at 16°C.
PBSase is less thermostable than PETase by 6-10°C, with a melting point of about 38°C. Catalytic activity of PBSase against pNPA as well as against PET-nanoparticles remains undetermined. Likely, the catalytic activity against both substrates is weaker than the activity of PETase. One turbidimetric analysis using 110 nM of PBSase suggests that PBSase might have a strong ability to hydrolyze PET.
Using SHuffle T7 Express as expression host, PETase was synthesized as a soluble and functional protein. Specific activity against 1 mM pNPA was determined to be 18.2 U/mg and could be further increased by additional purification. Thermostability was determined by NanoDSF. The measured Tm of 44.7°C is less than Tms measured by other research groups (Austin et al., 2018; Joo et al., 2018), which could be caused by use of SHuffle T7 Express as expression host.
The usefulness of turbidimetric analysis, using PET nanoparticles from amorphous PET-foil was demonstrated using various concentrations of PETase.
Keywords (eng)
PET-hydrolasePBS-depolymeraseAcidovorax delafieldiiIdeonella sakaiensisProtein synthesisPolymer degradationnanoparticlescharacterization
Keywords (deu)
PET-hydrolasePBS-depolymeraseAcidovorax delafieldiiIdeonella sakaiensisProteinsynthesePolymerdegradationNanopartikelCharakterisierung
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1350430
rdau:P60550 (deu)
72 Seiten : Diagramme
Number of pages
71
Study plan
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie
[UA]
[066]
[830]
Association (deu)
Title (eng)
Investigating the properties of PET-hydrolase and PBS-depolymerase
Parallel title (deu)
Untersuchung der Eigenschaften von PET-hydrolase und PBS-depolymerase
Author
Christoph Hinterberger
Abstract (deu)
Der Stamm SHuffle T7 Express war als einziger in der Lage, lösliche PBSase zu produzieren, wenn auch in sehr geringen Mengen. E. coli BL21(DE3) war wahrscheinlich in der Lage PelB-PBSase zu synthetisieren, aber der Großteil des Enzyms war weder im löslichen, noch im unlöslichen Teil des Zelllysates zu finden. Es ist empfehlenswert in zukünftigen Experimenten das Expressionsmedium eines solchen Stammes auf den Verbleib der PBSase zu untersuchen.
Das Signalpeptid der PBSase hat wahrscheinlich einen verzögerten, aber letalen Effekt auf E. coli, unabhängig ob die Zellen bei 4°C gelagert werden, oder bei 16°C weiter wachsen.
PBSase hat einen Schmelzpunkt bei etwa 38°C und ist damit um etwa 6-10°C weniger thermostabil als PETase. Die katalytische Aktivität der PBSase gegen pNPA und PET konnte nicht genau bestimmt werden, erscheint aber um einige Grade schwächer als die Aktivität der PETase. Eine turbidimetrische Analyse zeigte eine starke Aktivität von PBSase gegen PET-nanopartikel.
Unter Verwendung des Stammes Shuffle T7 Express konnte PETase als lösliches und funktionelles Enzym produziert werden, und zeigte eine starke Aktivität gegen PET-nanopartikel. Die spezifische Aktivität gegen 1mM pNPA wurde errechnet und betrug 18.2 U/mg. Dieser Wert kann noch durch weitere Aufreinigung erhöht werden. Thermostabilität wurde gemessen mittels NanoDSF und die gemessene Schmelztemperatur betrug 44.7°C, was um 2-4°C weniger ist als die Schmelzpunkte, die von anderen Gruppen gemessen wurden (Austin et al., 2018; Joo et al., 2018). Dieser leicht niedrigere Schmelzpunkt könnte durch die Verwendung von Shuffle T7 Express als Expressionsstamm zustande gekommen sein.
Die turbidimetrische Analyse unter Verwendung von PET-nanopartikeln, die aus amorpher PET-folie hergestellt wurden, wurde mit dem Einsatz von verschiedenen Konzentrationen von PETase demonstriert.
Abstract (eng)
Only SHuffle T7 Express was able to produce soluble PBSase, albeit in very low quantities. E. coli BL21(DE3) was likely able to produce pelB-PBSase, but the bulk of the enzyme, soluble or insoluble, could not be found when analyzing cell lysates. In future experiments, the expression media of such cultures should be investigated for the presence of PBSase.
The signal peptide of PBSase likely has a delayed, lethal effect on E. coli, stored at 4°C, or growing at 16°C.
PBSase is less thermostable than PETase by 6-10°C, with a melting point of about 38°C. Catalytic activity of PBSase against pNPA as well as against PET-nanoparticles remains undetermined. Likely, the catalytic activity against both substrates is weaker than the activity of PETase. One turbidimetric analysis using 110 nM of PBSase suggests that PBSase might have a strong ability to hydrolyze PET.
Using SHuffle T7 Express as expression host, PETase was synthesized as a soluble and functional protein. Specific activity against 1 mM pNPA was determined to be 18.2 U/mg and could be further increased by additional purification. Thermostability was determined by NanoDSF. The measured Tm of 44.7°C is less than Tms measured by other research groups (Austin et al., 2018; Joo et al., 2018), which could be caused by use of SHuffle T7 Express as expression host.
The usefulness of turbidimetric analysis, using PET nanoparticles from amorphous PET-foil was demonstrated using various concentrations of PETase.
Keywords (eng)
PET-hydrolasePBS-depolymeraseAcidovorax delafieldiiIdeonella sakaiensisProtein synthesisPolymer degradationnanoparticlescharacterization
Keywords (deu)
PET-hydrolasePBS-depolymeraseAcidovorax delafieldiiIdeonella sakaiensisProteinsynthesePolymerdegradationNanopartikelCharakterisierung
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1350431
Number of pages
71
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