Die Z-Scheibe ist ein komplexes Netzwerk bestehend aus mehr als 40 verschiedenen Proteinen, welches die Generation einer kontrollierten, unidirektionalen Kontraktion koordiniert. Myotilin, ein wichtiger Bestandteil dieses Netzwerks, organisiert Aktinfilamente, außerdem verankert und stabilisiert es andere Proteine der Z-Scheibe auf Aktinfilamenten. Myotilin steht im Zentrum zahlreicher Studien, da Punktmutationen in Myotilin zum Ordnungsverlust in Sarkomeren und zur Ansammlung schädlicher Proteinaggregate führen, welche schwere Myopathien verursachen. Obwohl das dynamische Verhalten und die komplexe Regulierung von Myotilin durch post- translationale Modifikation vielfach untersucht wurden, ist bis heute nicht bekannt, welche Rolle es neben der Interaktion mit Aktin spielt. In dieser Arbeit haben wir entdeckt, dass Myotilin ein Substrat von Calcineurin (CN) ist, eine Ca2+-abhängige Ser/Thr-Phosphatase, welche Muskelhypertrophie, Faser-Remodelling, Muskelregeneration und Muskelabbau aktiviert. Durch Pulldown-Assays konnten wir zeigen, dass Myotilin direct mit CN interagieren kann. Mithilfe von CelluSpots Overlay Assays haben wir die Region in Myotilin bestimmt, welche an dieser Interaktion beteiligt ist. Diese Region enthält eine Sequenz, welche dem LxVP-Motiv ähnelt, eines von zwei kanonischen Substraterkennungsmotiven von CN. Wir konnten die Kristallstruktur eines Komplexes, bestehend aus CN und einem Myotilin-Peptid, mit einer Auflösung von 2.77 Å bestimmen. Dadurch konnten wir bestätigen, dass Myotilin durch sein LxVP Motiv mit CN interagiert. Mittels Isothermaler Kalorimetrie haben wir die Affinität von Myotilin zu CN gemessen, welche - charakteristisch für CN-Substrate - im niedrigen mikromolaren Bereich liegt. Schlussendlich haben wir Desphosphorylierungs-Assays mit phosphorylierten Myotilin-Peptiden durchgeführt. Diese zeigten, dass CN in der Lage ist, Myotilin an drei verschiedenen Positionen in vitro zu dephosphorylieren, Ser229, Ser231 und Ser233. Unsere Ergebnisse deuten auf einen komplexeren Mechanismus der Myotilin Regulation hin. Wir vermuten, dass die 30 Aminosäuren lange Region in Myotilin, welche vom LxVP Motiv bis zur ersten Ig-Domäne reicht, ein Regulations-Hotspot ist. Obwohl kürzlich berichtet wurde, dass Myotilin eine dynamische Rolle als wichtiger Marker von Muskel-Remodelling in Aktivitäts- induzierten Muskelschäden spielt, ist wenig über seine Regulierung bekannt. Diese Arbeit soll als Ansatz dienen, diese wichtigen Prozesse zu untersuchen, da CN das Enzym sein könnte, welches Myotilin-Turnover an der Z-Scheibe und seine Rekrutierung an Stellen von Muskelschäden antreibt.

The Z-disc is an intricate assembly of over 40 different proteins, which coordinates forces from different sarcomeres to give rise to a controlled, unidirectional contraction. Myotilin is an important component of this complex best known for its ability to organize filamentous actin (F- actin). In addition, myotilin binds and stabilizes other Z-disc proteins on F-actin. Myotilin is a target of extensive research, as point mutations of myotilin trigger disorganization of sarcomeres and harmful protein aggregation that cause severe myopathies. Although several studies have alluded to its dynamic nature and complex regulation through post-translational modifications, its function beyond F-actin binding remains poorly understood. In this study, we identified myotilin as a new substrate of calcineurin (CN), a Ca2+ dependent Ser/Thr phosphatase, which activates muscle hypertrophy, fiber remodeling, repair or muscle degradation. Firstly, by using pulldown assays, we showed that myotilin can directly interact with CN. Secondly, by using CelluSpots overlay assays, we identified a region of myotilin containing a sequence resembling the LxVP motif, one of the two established substrate recognition motifs of CN, to be involved in this interaction. Next, we crystallized CN in complex with a myotilin peptide and determined its structure at 2.77 Å, which unambiguously showed myotilin to interact with CN via its LxVP motif. In addition, by using ITC, we found the affinity of myotilin to CN to be in micromolar range, typical for CN substrates. Finally, dephosphorylation assays performed with phosphorylated peptides of myotilin showed that CN is able to dephosphorylate three serine residues of myotilin, namely Ser229, Ser231 and Ser233 in vitro. Altogether, our findings allude to a more complex mechanism of myotilin regulation. We speculate that the 30 residue long stretch of myotilin spanning from the LxVP motif to the first Ig domain could be a hot-spot of myotilin regulation. Although myotilin was recently reported to have a more dynamic function as a major marker of muscle remodeling in exercise induced muscle lesions, little is known about its regulation. Our findings could be used as a starting point of investigating these important processes, as CN could be the enzyme which drives myotilin turnover at the Z-disc and its recruitment to the sites of muscle lesion.