Title (eng)
Lung cancer: chemosensitivity and PD-L1 expression of primary non-small cell lung (NSCLC) cancer cell lines
Parallel title (deu)
Lungenkrebs : Chemosensitivität und PD-L1 Expression von primären nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinien
Author
Adelina Sophia Plangger
Advisor
Robert Zeillinger
Assessor
Robert Zeillinger
Abstract (deu)
Der nicht-kleinzellige Lungenkrebs (NSCLC) macht zirka 85% der Lungenkrebsarten aus. Die klassische Therapiemöglichkeit zur Behandlung von Lungenkrebs besteht aus platinbasierten Medikamenten (Cisplatin oder Carboplatin) in Kombination mit Docetaxel, Etoposid oder Pemetrexed, aber bisher beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate trotz dieser Kombination nur rund 20%. Patienten, die eine Mutation in einer „Treiber Kinase“ wie EGFR, ALK oder ROS1 haben, sind empfänglich für gezielte Therapien mit spezifischen Tyrosin Kinase Inhibitoren (TKIs) was zu einem verbesserten Überleben mit mehr als 5 Jahren führen kann. Dennoch müssen Patienten, die unter TKI Behandlung einen Progress erleiden, mit einer zytotoxischen Chemotherapie behandelt werden. Chemoresistenz wird oft bei Patienten beobachtet, die mit platinbasierten Medikamenten behandelt wurden. In dieser Arbeit wurde die Sensitivität von PD-L1 negativen primären NSCLC und permanenten Lungenkrebs Linien mittels Proliferationsassays, Immunofluoreszenztests, Polymerasekettenreaktion und Westernblot Arrays untersucht. Die Ergebnisse der Cisplatin Zytotoxizitätstests zeigen, dass die meisten pleuralen NSCLC Linien IC50 Werte aufweisen, die nahe bei 3 µg/ml liegen. Dieser Wert entspricht in etwa der klinischen Spitzenplasmakonzentration und indiziert deshalb Chemoresistenz der Zellen. Die NSCLC zu SCLC transformierten Pleurazelllinien BH659 und BH686 erwiesen sich als hoch chemosensitiv. Um die zytotoxische Wirkung von Cisplatin zu verstärken, wurden Kombinationen mit dem Chk-1/2-Inhibitor AZD-7762, dem HSP90-Inhibitor STA9090, dem Nrf-2-Inhibitor ML385, dem Multitargetinhibitor Niclosamid und dem Signaltransduktionshemmer Pristimerin durchgeführt. AZD-7762, das eine Initiation der Reparatur der DNA Schäden inhibiert, und Multitarget Niclosamid ergaben die höchste Rate synergistischer Zytotoxizität in Kombination mit Cisplatin, während Versuche mit mehreren Krebslinien und anderen Modulatoren negative Ergebnisse lieferten. Um die Zytotoxizitätstests auf ein repräsentativeres in vivo-ähnliches Tumormodell auszudehnen, wurden 3D-Aggregate getestet, die in mit Agarose beschichteten Kulturflaschen kultiviert wurden. Die meisten Linien zeigten eine erhöhte Resistenz gegen Cisplatin als 3D-Aggregate und mit Ausnahme von Niclosamid Kombinationen waren die Modulatoren gegenüber solchen Zellaggregaten weniger wirksam. Mittels Westernblot Arrays wurden die spezifischen Phosphorylierungsstellen von Chk-2, ERK1/2, AKT1/2/3, c-Jun, STAT3 und die Proteinexpression von HSP60 untersucht. Chk-2, c-Jun, STAT3 und HSP60 zeigten die häufigsten Anstiege der Phosphorylierung oder Proteinexpression als Reaktion auf die Vorbehandlung der Zellen mit Cisplatin. Die Cisplatin-induzierte Phosphorylierung wurde in Zelllinien verstärkt, die zu Beginn basale Phosphorylierungsgrade aufwiesen. Die transformierten Zelllinien BH659 und BH686 zeigten eine geringe und gleichmäßige Erhöhung des Phosphorylierungsstatus derselben Proteine. Ihre tatsächliche Transformation in einen SCLC-Phänotyp wurde durch den Nachweis der Expression typischer Marker wie CHGA, SYP und ENO-2 mittels qPCR bestätigt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die primären pleuralen NSCLC Linien unabhängig von der Art der klinischen Vorbehandlung eine hohe Resistenz gegen Cisplatin aufweisen und dass diese Resistenz durch eine Reihe von Modulatoren in 2D und mit noch geringerer Wirksamkeit in 3D-Kulturen nicht effizient rückgängig gemacht werden kann. In einem kürzlich unternommenen Versuch, die klinische Wirksamkeit der Chemotherapie bei NSCLC-Patienten zu verbessern, wurden die klassischen Chemotherapeutika mit monoklonalen Antikörpern gegen PD-L1 und PD-1 kombiniert, was unabhängig von der Checkpoint-Marker-Expression zu einem verbesserten progressionsfreien Überleben führte. In Abwesenheit geeigneter Marker für die Vorhersage der Wirksamkeit einer Immunchemotherapie kann daher die Beurteilung der Cisplatinsensitivität oder des Phosphorylierungsstatus von Chk-1/2, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, nützlich sein, um geeignete Patienten für weiterführende Studien auszuwählen.
Abstract (eng)
Approximately 85% of lung cancer cases represent Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC). The classical therapy for the treatment of NSCLC consists of a platinum-based drug (cisplatin or carboplatin) in combination with either docetaxel, etoposide or pemetrexed, but these regimens of combination chemotherapy result in a low 5-year survival rate of about 20%. Patients who exhibit mutations in driver kinases such as EGFR, ALK or ROS1 are amenable to targeted therapy with specific tyrosine kinase inhibitors (TKIs) yielding improved survival for more than 5 years. Still, patients progressing under TKI therapy have to be treated with cytotoxic chemotherapy. Chemoresistance via different mechanisms is frequently observed in patients treated with platinum-based drugs. In the present study, the sensitivity of PD-L1-negative primary pleural NSCLC and permanent lung cancer cell lines was investigated using proliferation assays, immunofluorescence tests, polymerase chain reaction (PCR) and Western blot arrays. Results of cisplatin cytotoxicity tests demonstrate that most of the pleural NSCLC lines exhibit IC50 values of approximately 3 µg/ml which are near the clinical peak plasma concentration (PPC) of the drug and indicate chemoresistance. The NSCLC to Small Cell Lung Cancer (SCLC) transformed pleural cell lines BH659 and BH686 proved to be highly chemosensitive. In order to enhance the cytotoxic effects of cisplatin, combinations with the Chk-1/2 inhibitor AZD-7762, HSP90 inhibitor STA9090, Nrf-2 inhibitor ML385, multitarget inhibitor niclosamide and signal transduction inhibitor pristimerin were performed. AZD-7762 targeting DNA damage response and multitarget niclosamide gave the highest rate of synergistic cytotoxicity with cisplatin but several cancer lines and the other modulators yielded negative results. To expand the cytotoxicity tests to a more representative in vivo-like tumor model, 3D spheroids generated on agarose-coated culture flasks were tested. Most cell lines exhibited increased resistance to cisplatin in form of 3D cultures and, with exception of some niclosamide combinations, the modulators were less efficient against such cellular aggregates. Distinct phosphorylation sites of Chk-2, ERK1/2, AKT1/2/3, c-Jun, STAT3 and HSP60 protein expression were assessed with Western blot arrays. Chk-2, c-Jun, STAT3 and HSP60 showed the most frequent increases in phosphorylation in response to pretreatment of the cells with cisplatin. The cisplatin-enhanced phosphorylation or protein expression was higher in cell lines exhibiting basal levels of phosphorylation in the beginning. The transformed cell lines BH659 and BH686 revealed low and uniform increases of the phosphorylation status of the same proteins and their actual transformation to a SCLC phenotype was confirmed by the proof of the expression of typical markers such as chromogranin A (CHGA), synaptophysin (SYP) and ENO-2 by qPCR.
In conclusion, the primary pleural NSCLC lines show high resistance to cisplatin, independently of the mode of clinical pretreatment and this refractoriness could not be efficiently reversed by a range of modulators in 2D and with even less potency in 3D cultures. In a recent attempt to improve the clinical efficacy of chemotherapy for NSCLC patients, the classical chemotherapeutics were combined with immune checkpoint monoclonal antibodies directed to PD-L1 and PD-1 resulting in improved progression-free and overall survival independently of checkpoint marker expression. Therefore, in the absence of suitable markers for the prediction of the efficacy of an immunochemotherapy treatment, assessment of the cisplatin sensitivity or phosphorylation status of Chk-1/2 as shown in the present work may be useful to select suitable patients for further studies.
Keywords (eng)
Lung cancerchemoresistancecisplatinPD-L1
Keywords (deu)
LungenkrebsChemoresistenzCisplatinPD-L1
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1361663
rdau:P60550 (deu)
VI, 53 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
69
Association (deu)
Title (eng)
Lung cancer: chemosensitivity and PD-L1 expression of primary non-small cell lung (NSCLC) cancer cell lines
Parallel title (deu)
Lungenkrebs : Chemosensitivität und PD-L1 Expression von primären nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinien
Author
Adelina Sophia Plangger
Abstract (deu)
Der nicht-kleinzellige Lungenkrebs (NSCLC) macht zirka 85% der Lungenkrebsarten aus. Die klassische Therapiemöglichkeit zur Behandlung von Lungenkrebs besteht aus platinbasierten Medikamenten (Cisplatin oder Carboplatin) in Kombination mit Docetaxel, Etoposid oder Pemetrexed, aber bisher beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate trotz dieser Kombination nur rund 20%. Patienten, die eine Mutation in einer „Treiber Kinase“ wie EGFR, ALK oder ROS1 haben, sind empfänglich für gezielte Therapien mit spezifischen Tyrosin Kinase Inhibitoren (TKIs) was zu einem verbesserten Überleben mit mehr als 5 Jahren führen kann. Dennoch müssen Patienten, die unter TKI Behandlung einen Progress erleiden, mit einer zytotoxischen Chemotherapie behandelt werden. Chemoresistenz wird oft bei Patienten beobachtet, die mit platinbasierten Medikamenten behandelt wurden. In dieser Arbeit wurde die Sensitivität von PD-L1 negativen primären NSCLC und permanenten Lungenkrebs Linien mittels Proliferationsassays, Immunofluoreszenztests, Polymerasekettenreaktion und Westernblot Arrays untersucht. Die Ergebnisse der Cisplatin Zytotoxizitätstests zeigen, dass die meisten pleuralen NSCLC Linien IC50 Werte aufweisen, die nahe bei 3 µg/ml liegen. Dieser Wert entspricht in etwa der klinischen Spitzenplasmakonzentration und indiziert deshalb Chemoresistenz der Zellen. Die NSCLC zu SCLC transformierten Pleurazelllinien BH659 und BH686 erwiesen sich als hoch chemosensitiv. Um die zytotoxische Wirkung von Cisplatin zu verstärken, wurden Kombinationen mit dem Chk-1/2-Inhibitor AZD-7762, dem HSP90-Inhibitor STA9090, dem Nrf-2-Inhibitor ML385, dem Multitargetinhibitor Niclosamid und dem Signaltransduktionshemmer Pristimerin durchgeführt. AZD-7762, das eine Initiation der Reparatur der DNA Schäden inhibiert, und Multitarget Niclosamid ergaben die höchste Rate synergistischer Zytotoxizität in Kombination mit Cisplatin, während Versuche mit mehreren Krebslinien und anderen Modulatoren negative Ergebnisse lieferten. Um die Zytotoxizitätstests auf ein repräsentativeres in vivo-ähnliches Tumormodell auszudehnen, wurden 3D-Aggregate getestet, die in mit Agarose beschichteten Kulturflaschen kultiviert wurden. Die meisten Linien zeigten eine erhöhte Resistenz gegen Cisplatin als 3D-Aggregate und mit Ausnahme von Niclosamid Kombinationen waren die Modulatoren gegenüber solchen Zellaggregaten weniger wirksam. Mittels Westernblot Arrays wurden die spezifischen Phosphorylierungsstellen von Chk-2, ERK1/2, AKT1/2/3, c-Jun, STAT3 und die Proteinexpression von HSP60 untersucht. Chk-2, c-Jun, STAT3 und HSP60 zeigten die häufigsten Anstiege der Phosphorylierung oder Proteinexpression als Reaktion auf die Vorbehandlung der Zellen mit Cisplatin. Die Cisplatin-induzierte Phosphorylierung wurde in Zelllinien verstärkt, die zu Beginn basale Phosphorylierungsgrade aufwiesen. Die transformierten Zelllinien BH659 und BH686 zeigten eine geringe und gleichmäßige Erhöhung des Phosphorylierungsstatus derselben Proteine. Ihre tatsächliche Transformation in einen SCLC-Phänotyp wurde durch den Nachweis der Expression typischer Marker wie CHGA, SYP und ENO-2 mittels qPCR bestätigt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die primären pleuralen NSCLC Linien unabhängig von der Art der klinischen Vorbehandlung eine hohe Resistenz gegen Cisplatin aufweisen und dass diese Resistenz durch eine Reihe von Modulatoren in 2D und mit noch geringerer Wirksamkeit in 3D-Kulturen nicht effizient rückgängig gemacht werden kann. In einem kürzlich unternommenen Versuch, die klinische Wirksamkeit der Chemotherapie bei NSCLC-Patienten zu verbessern, wurden die klassischen Chemotherapeutika mit monoklonalen Antikörpern gegen PD-L1 und PD-1 kombiniert, was unabhängig von der Checkpoint-Marker-Expression zu einem verbesserten progressionsfreien Überleben führte. In Abwesenheit geeigneter Marker für die Vorhersage der Wirksamkeit einer Immunchemotherapie kann daher die Beurteilung der Cisplatinsensitivität oder des Phosphorylierungsstatus von Chk-1/2, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, nützlich sein, um geeignete Patienten für weiterführende Studien auszuwählen.
Abstract (eng)
Approximately 85% of lung cancer cases represent Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC). The classical therapy for the treatment of NSCLC consists of a platinum-based drug (cisplatin or carboplatin) in combination with either docetaxel, etoposide or pemetrexed, but these regimens of combination chemotherapy result in a low 5-year survival rate of about 20%. Patients who exhibit mutations in driver kinases such as EGFR, ALK or ROS1 are amenable to targeted therapy with specific tyrosine kinase inhibitors (TKIs) yielding improved survival for more than 5 years. Still, patients progressing under TKI therapy have to be treated with cytotoxic chemotherapy. Chemoresistance via different mechanisms is frequently observed in patients treated with platinum-based drugs. In the present study, the sensitivity of PD-L1-negative primary pleural NSCLC and permanent lung cancer cell lines was investigated using proliferation assays, immunofluorescence tests, polymerase chain reaction (PCR) and Western blot arrays. Results of cisplatin cytotoxicity tests demonstrate that most of the pleural NSCLC lines exhibit IC50 values of approximately 3 µg/ml which are near the clinical peak plasma concentration (PPC) of the drug and indicate chemoresistance. The NSCLC to Small Cell Lung Cancer (SCLC) transformed pleural cell lines BH659 and BH686 proved to be highly chemosensitive. In order to enhance the cytotoxic effects of cisplatin, combinations with the Chk-1/2 inhibitor AZD-7762, HSP90 inhibitor STA9090, Nrf-2 inhibitor ML385, multitarget inhibitor niclosamide and signal transduction inhibitor pristimerin were performed. AZD-7762 targeting DNA damage response and multitarget niclosamide gave the highest rate of synergistic cytotoxicity with cisplatin but several cancer lines and the other modulators yielded negative results. To expand the cytotoxicity tests to a more representative in vivo-like tumor model, 3D spheroids generated on agarose-coated culture flasks were tested. Most cell lines exhibited increased resistance to cisplatin in form of 3D cultures and, with exception of some niclosamide combinations, the modulators were less efficient against such cellular aggregates. Distinct phosphorylation sites of Chk-2, ERK1/2, AKT1/2/3, c-Jun, STAT3 and HSP60 protein expression were assessed with Western blot arrays. Chk-2, c-Jun, STAT3 and HSP60 showed the most frequent increases in phosphorylation in response to pretreatment of the cells with cisplatin. The cisplatin-enhanced phosphorylation or protein expression was higher in cell lines exhibiting basal levels of phosphorylation in the beginning. The transformed cell lines BH659 and BH686 revealed low and uniform increases of the phosphorylation status of the same proteins and their actual transformation to a SCLC phenotype was confirmed by the proof of the expression of typical markers such as chromogranin A (CHGA), synaptophysin (SYP) and ENO-2 by qPCR.
In conclusion, the primary pleural NSCLC lines show high resistance to cisplatin, independently of the mode of clinical pretreatment and this refractoriness could not be efficiently reversed by a range of modulators in 2D and with even less potency in 3D cultures. In a recent attempt to improve the clinical efficacy of chemotherapy for NSCLC patients, the classical chemotherapeutics were combined with immune checkpoint monoclonal antibodies directed to PD-L1 and PD-1 resulting in improved progression-free and overall survival independently of checkpoint marker expression. Therefore, in the absence of suitable markers for the prediction of the efficacy of an immunochemotherapy treatment, assessment of the cisplatin sensitivity or phosphorylation status of Chk-1/2 as shown in the present work may be useful to select suitable patients for further studies.
Keywords (eng)
Lung cancerchemoresistancecisplatinPD-L1
Keywords (deu)
LungenkrebsChemoresistenzCisplatinPD-L1
Subject (deu)
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https://phaidra.univie.ac.at/o:1361664
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69
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