Title (eng)
Accurate characterization of β-amyloid (Aβ40, Aβ42) standards using species-specific HPLC-ICP-MS/MS
Parallel title (deu)
Akkurate Charakterisierung von β-Amyloid-Standards (Aβ40, Aβ42) unter Verwendung speziesspezifischer HPLC-ICP-MS/MS
Author
Martin Schaier
Advisor
Gunda Köllensperger
Assessor
Gunda Köllensperger
Abstract (deu)
Eine der größten Herausforderungen in der heutigen Medizin ist der Kampf gegen neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit. Ein entscheidendes pathologisches Merkmal ist die Bildung von Plaques in den extrazellulären Regionen des Gehirns, wobei das β-Amyloid (Aβ40, Aβ42)-Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen darstellt. Daher bietet die Untersuchung dieses Peptids die Möglichkeit, einen besseren Einblick in die Prozesse einer so komplexen Krankheit zu erhalten.
Für die klinische Analyse werden hierfür geeignete Standards benötigt, welche jedoch nicht leicht zu finden sind, da nur wenige kommerziell erhältlich sind und diese oft in ihrer Reinheit variieren. Weiterhin wird die Bestimmung der absoluten Konzentration für die meisten Proteinstandards auf nicht rückverfolgbare Weise durchgeführt, z.B. mittels Bradford-Assay, bei welchem Albumin für die Kalibration herangezogen wird. Daher sind genauere Methoden erforderlich, um diese Standards zu charakterisieren.
Ziel dieser Studie war es, synthetische β-Amyloid-Standards (bezogen von r-Peptide) durch Analyse des Schwefelgehalts ihrer Aminosäuren zu quantifizieren. Zu diesem Zweck wurde eine Säurehydrolyse des Peptids durchgeführt. Die so erhaltenen einzelnen Aminosäuren wurden mittels einer starken Anionenaustauschersäule aufgetrennt und direkt über Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS/MS) im Sauerstoffmodus analysiert. Speziesspezifische Isotopenverdünnung wurde unter Verwendung eines 34S-angereicherten Hefehydrolysats angewandt, um mögliche Verluste bei der Probenvorbereitung zu korrigieren. Um die etablierte Methode in geeigneter Weise für die Aminosäuren Methionin und Cystein zu validieren, wurde ein Standard-Referenzmaterial (NIST 2389a) verwendet. Zusätzlich wurden die kommerziell erhältlichen Proteine Lysozym und Myoglobin durch dieses Verfahren erfolgreich quantifiziert. Die Messung der ganzen Protein- und Peptidstandards mittels Größenausschlusschromatographie ermöglichte eine weitere Charakterisierung ihrer Reinheit. Um dabei Kontaminationen mit Schwefel zu vermeiden, wurden alle Verbrauchsmaterialien mit Salpetersäure vorgereinigt. Letztendlich ermöglichte die Kombination von HPLC-ICP-MS/MS mit speziesspezifischer ID die genaue Quantifizierung von β-Amyloid-Standards mit hohem Durchsatz und geringem Probenverbrauch.
Abstract (eng)
One of the greatest challenges in medicine today is the fight against neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease. A defining pathological feature is the formation of plaques in the extracellular regions of the brain with the β-Amyloid (Aβ40, Aβ42) peptide being the main component of this deposit. Therefore, the study of this peptide gives the opportunity to get a better insight into the processes of this complex disease.
For clinical analysis one needs suitable standards, but it is not an easy task to find them, since only a few are commercially available, and these vary in their purity. Furthermore, the determination of absolute concentration in most protein standards is performed in a non-traceable manner, by e.g. Bradford assay in which albumin is used as a calibrant. Hence, accurate methods are needed to characterize these standards.
The aim of this study was to quantify synthetic β-Amyloid standards (purchased from r-Peptide) by analysing the sulfur-content of its amino acids. For this purpose, an acid-hydrolysis of the peptide was performed. The so obtained individual amino acids were separated by means of a strong anion exchange column and directly analysed with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS/MS) in oxygen mode. Species-specific isotope dilution was applied using an 34S-enriched yeast hydrolysate to correct for potential losses within sample preparation. In order to validate the established method in an appropriate manner for the amino acids, methionine and cysteine, a standard reference material (NIST 2389a) was used. In addition, the commercially available proteins lysozyme and myoglobin were successfully quantified by this procedure. Measuring the whole protein and peptide standards via size exclusion chromatography allowed further characterization of their purity. To prevent sulfur contamination, all consumables were pre-cleaned with nitric acid. Ultimately the combination of HPLC-ICP-MS/MS with species-specific ID allowed us to accurately quantify β-Amyloid standards with high throughput and low volume consumption.
Keywords (eng)
Alzheimer´s diseaseβ-AmyloidAβ40Aβ42peptideproteinstandardsICP-MSHPLCisotope dilutionspecies-specificanion exchange chromatographysize exclusion chromatographyreversed phase chromatographyelemental analysis
Keywords (deu)
Alzheimerβ-AmyloidAβ40Aβ42PeptideProteineStandardsICP-MSHPLCIsotopenverdünnungspeziesspezifischAnionenaustausch-ChromatographieGrößenausschluss-ChromatographieUmkehrphasen-ChromatographieElementanalytik
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1390802
rdau:P60550 (deu)
78 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
80
Association (deu)
Title (eng)
Accurate characterization of β-amyloid (Aβ40, Aβ42) standards using species-specific HPLC-ICP-MS/MS
Parallel title (deu)
Akkurate Charakterisierung von β-Amyloid-Standards (Aβ40, Aβ42) unter Verwendung speziesspezifischer HPLC-ICP-MS/MS
Author
Martin Schaier
Abstract (deu)
Eine der größten Herausforderungen in der heutigen Medizin ist der Kampf gegen neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit. Ein entscheidendes pathologisches Merkmal ist die Bildung von Plaques in den extrazellulären Regionen des Gehirns, wobei das β-Amyloid (Aβ40, Aβ42)-Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen darstellt. Daher bietet die Untersuchung dieses Peptids die Möglichkeit, einen besseren Einblick in die Prozesse einer so komplexen Krankheit zu erhalten.
Für die klinische Analyse werden hierfür geeignete Standards benötigt, welche jedoch nicht leicht zu finden sind, da nur wenige kommerziell erhältlich sind und diese oft in ihrer Reinheit variieren. Weiterhin wird die Bestimmung der absoluten Konzentration für die meisten Proteinstandards auf nicht rückverfolgbare Weise durchgeführt, z.B. mittels Bradford-Assay, bei welchem Albumin für die Kalibration herangezogen wird. Daher sind genauere Methoden erforderlich, um diese Standards zu charakterisieren.
Ziel dieser Studie war es, synthetische β-Amyloid-Standards (bezogen von r-Peptide) durch Analyse des Schwefelgehalts ihrer Aminosäuren zu quantifizieren. Zu diesem Zweck wurde eine Säurehydrolyse des Peptids durchgeführt. Die so erhaltenen einzelnen Aminosäuren wurden mittels einer starken Anionenaustauschersäule aufgetrennt und direkt über Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS/MS) im Sauerstoffmodus analysiert. Speziesspezifische Isotopenverdünnung wurde unter Verwendung eines 34S-angereicherten Hefehydrolysats angewandt, um mögliche Verluste bei der Probenvorbereitung zu korrigieren. Um die etablierte Methode in geeigneter Weise für die Aminosäuren Methionin und Cystein zu validieren, wurde ein Standard-Referenzmaterial (NIST 2389a) verwendet. Zusätzlich wurden die kommerziell erhältlichen Proteine Lysozym und Myoglobin durch dieses Verfahren erfolgreich quantifiziert. Die Messung der ganzen Protein- und Peptidstandards mittels Größenausschlusschromatographie ermöglichte eine weitere Charakterisierung ihrer Reinheit. Um dabei Kontaminationen mit Schwefel zu vermeiden, wurden alle Verbrauchsmaterialien mit Salpetersäure vorgereinigt. Letztendlich ermöglichte die Kombination von HPLC-ICP-MS/MS mit speziesspezifischer ID die genaue Quantifizierung von β-Amyloid-Standards mit hohem Durchsatz und geringem Probenverbrauch.
Abstract (eng)
One of the greatest challenges in medicine today is the fight against neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease. A defining pathological feature is the formation of plaques in the extracellular regions of the brain with the β-Amyloid (Aβ40, Aβ42) peptide being the main component of this deposit. Therefore, the study of this peptide gives the opportunity to get a better insight into the processes of this complex disease.
For clinical analysis one needs suitable standards, but it is not an easy task to find them, since only a few are commercially available, and these vary in their purity. Furthermore, the determination of absolute concentration in most protein standards is performed in a non-traceable manner, by e.g. Bradford assay in which albumin is used as a calibrant. Hence, accurate methods are needed to characterize these standards.
The aim of this study was to quantify synthetic β-Amyloid standards (purchased from r-Peptide) by analysing the sulfur-content of its amino acids. For this purpose, an acid-hydrolysis of the peptide was performed. The so obtained individual amino acids were separated by means of a strong anion exchange column and directly analysed with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS/MS) in oxygen mode. Species-specific isotope dilution was applied using an 34S-enriched yeast hydrolysate to correct for potential losses within sample preparation. In order to validate the established method in an appropriate manner for the amino acids, methionine and cysteine, a standard reference material (NIST 2389a) was used. In addition, the commercially available proteins lysozyme and myoglobin were successfully quantified by this procedure. Measuring the whole protein and peptide standards via size exclusion chromatography allowed further characterization of their purity. To prevent sulfur contamination, all consumables were pre-cleaned with nitric acid. Ultimately the combination of HPLC-ICP-MS/MS with species-specific ID allowed us to accurately quantify β-Amyloid standards with high throughput and low volume consumption.
Keywords (eng)
Alzheimer´s diseaseβ-AmyloidAβ40Aβ42peptideproteinstandardsICP-MSHPLCisotope dilutionspecies-specificanion exchange chromatographysize exclusion chromatographyreversed phase chromatographyelemental analysis
Keywords (deu)
Alzheimerβ-AmyloidAβ40Aβ42PeptideProteineStandardsICP-MSHPLCIsotopenverdünnungspeziesspezifischAnionenaustausch-ChromatographieGrößenausschluss-ChromatographieUmkehrphasen-ChromatographieElementanalytik
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1390803
Number of pages
80
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