Abstract (deu)
Die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen wird von der Europäischen Union (EU) und der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als eine der größten globalen Bedrohungen der Gesundheit angesehen1.
Die größte Gefahr geht von multiresistenten Krankheitserregern aus, die gegen viele der häufig verwendeten Antibiotika resistent sind. Beispiele für diese sind Carbapenem-resistente und β‑Lactamase produzierende Enterobacteriaceae oder die sechs Krankenhauskeime, die unter dem Akronym ESKAPE zusammengefasst werden: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp. Solche multiresistenten Krankheitserreger stellen im klinischen Bereich eine große Gefahr dar, z. B. während chirurgischer Eingriffe, der Krebstherapie und insbesondere für immungeschwächte Patienten. Schätzungen zufolge werden 2050 jährlich bis zu 10 Millionen Menschen an antibiotikaresistenten Krankheitserregern sterben1.
Antibiotika werden in der Landwirtschaft im Überschuss eingesetzt, aber auch außerhalb der großen Kliniken von Medizinern ohne geeignete diagnostische Verfahren verschrieben. Die Entscheidung, ob Antibiotika verschrieben werden, wird zum Großteil empirisch getroffen. Ein zentraler Bestandteil der Lösung dieser Problematik ist die Entwicklung schneller und spezifischer Diagnosemethoden (Point-of-Care-devices, POC). Dies könnte zu einer umfassenden Verringerung des Medikamentenkonsums führen und somit die weitere Ausbreitung der Antibiotikaresistenzen minimieren.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines solchen Diagnoseverfahrens. Diese Arbeit bezieht sich dabei auf drei Publikationen, die einen wesentlichen Beitrag in diesem Bereich leisten.
In der Publikation Low-cost microarray platform to detect antibiotic resistance genes (Publikation 1) behandeln wir eine alternative Methode zur hausinternen Markierung von DNA-Oligonukleotiden, welche für die Signalgebung bei ligationsbasierten DNA-Microarray-Verfahren verwendet werden. Die alternative Markierung basiert auf einer terminalen Desoxynukleotidyltransferase-Reaktion, in welcher die DNA-Oligonukleotide in Gegenwart von Biotin-konjugierten Nukleotiden elongiert werden. Die hausinterne Markierung ermöglicht es, die hohen Kosten durch kommerziell markierte DNA-Oligonukleotide besonders im Fall von Hochdurchsatzverfahren zu reduzieren. Die selbstmarkierten Oligonukleotide zeigten hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität eine vergleichbare Leistung zu kommerziell markierten DNA-Oligonukleotiden, jedoch bei nur zehn Prozent der Kosten3.
iv
Die Publikation Crosslinking of PCR primers reduces unspecific amplification products in multiplex PCR (Publikation 2) behandelt die Problemstellung der Multiplex- Polymerasekettenreaktion (PCR). Die PCR ist für DNA-basierte Diagnosemethoden unerlässlich. Multiplex-PCRs sind besonders attraktiv, da sie die Anzahl der Einzelreaktionen reduzieren. Die Multiplexeffizienz wird jedoch durch Primer-Wechselwirkungen, wie zum Beispiel die Bildung von Primer-Dimeren, beeinträchtigt. In dieser Studie wurde eine kovalente Querverknüpfung von Primern über ihre 5'-Enden verwendet, um die unerwünschten Effekte zu vermeiden. Die Spezifität der Primer sowie die Effizienz der PCR konnten durch Primer-Querverknüpfung erhöht werden, was in PCRs mit bis zu 34 Primer-Paaren, abzielend auf die wichtigsten Antibiotika-Resistenzgene, im Vergleich zu nicht querverknüpften Primern nachgewiesen werden konnte4.
In der Veröffentlichung Full pathogen characterisation: Species identification including the detection of virulence factors and antibiotic resistance genes via multiplex DNA-assays (Publikation 3) wurde ein DNA-basierter Microarray entwickelt, der parallel auf 45 Sepsis-relevanten pathogenen Spezies, 360 Virulenzfaktor- und 409 Antibiotika-Resistenzgene prüft. Der Assay wurde mit 14 multiresistenten Stämmen evaluiert, darunter alle ESKAPE-Pathogene. Die verwendete Plattform wurde hinsichtlich Spezifität und Sensitivität optimiert.