Title (eng)
Generation of clonal cell lines from fibroblasts of female RETT syndrome patients
Author
Melanie Rebecka Olczykowski
Advisor
Manfred Ogris
Assessor
Manfred Ogris
Abstract (deu)
Das Rett Syndrom (RTT) ist eine X-chromosomale neurologische Entwicklungsstörung, die
bei Kindern auftritt. Die Hauptursachen für diese Erkrankung sind Mutationen im Methyl-CpG-Bindungsprotein 2 (MECP2) Gen, welches für das Protein MeCP2 codiert und als
entscheidender Modulator der Genexpression fungiert. Um die Entwicklung von Therapien
für RTT voranzutreiben ist es notwendig, geeignete Zellmodelle zu etablieren.
Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, einzelne Zellklone aus den Fibroblasten eines Rett-Patienten zu isolieren und dadurch monoklonale Zellen von mutiertem und Wildtyp MeCP2
zu erhalten. Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Methoden verwendet und
verglichen: Durchflusszytometrie, Limiting Dilution Cloning und QIAscout™. Es wurden
zahlreiche Vereinzelungen durchgeführt; Klone wurden mit verschiedenen Medien behandelt,
die Zellen wurden immortalisiert und mittels Elektroporation mit dem Plasmid pCl neo-hEST2 transfiziert. Nach Erhalt der Klone wurden diese dann durch
Immunfluoreszenzfärbung, HUMARA-Assay und Sanger-Sequenzierung charakterisiert. Die
Ergebnisse zeigten einen Unterschied hinsichtlich verschiedener Behandlungen von Klonen
sowie Zellen, die mit und ohne Plasmid behandelt wurden. Schließlich wurde der Status der
Histonacetylierung in monoklonalen Zellen, der wesentlich beim RTT ist, mittels Western
Blot mit einem gegen acetylisiertes Histon H3 bei Lys9 (H3k9) gerichteten Antikörper
bestimmt.
Zusammenfassend haben wir ein zelluläres Modell für das Rett-Syndrom entwickelt, bei dem
aus Einzelzellen stammende Wildtyp- und mutierte MeCP2-exprimierende Fibroblastenklone
mit einer häufigen Mutation in MeCP2 (705delG) verwendet wurden. Darüber hinaus konnten
wir in diesem Modell einen RETT-spezifischen Phänotyp zeigen, in dem wir den
Hyperacetylierungsstatus untersuchten. Dieses Zellmodell könnte für das Hochdurchsatz-Screening von Therapeutika, sowie der Diagnostik und der personalisierten Behandlung
dienen.
Abstract (eng)
Mutations in the methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) gene which encodes the protein
MeCP2, a crucial modulator of gene expression, are the main cause of Rett Syndrome (RTT),
an X-linked neurodevelopmental disorder that appears in children. In order to advance the
development of therapies for RTT, the need to establish the appropriate cell models is
apparent.
It is hence the aim of this work to isolate single cells from a Rett patient’s fibroblasts and
ultimately obtain monoclonal cells such as mutant and wildtype MeCP2 clones. For this
purpose, three different methods were used and compared: Flow cytometry (FC), limiting
dilution cloning and QIAscout™. Numerous seedings were performed; clones were treated
with various mediums, cells were immortalized and transfected with the plasmid pCl neo-hEST2 via electroporation. Clones were obtained and then characterized by
immunofluorescence staining, the HUMARA assay and Sanger sequencing. Results showed a
difference between different treatments of clones as well as cells that were treated with and
without plasmid. Lastly, the status of histone hyperacetylation in monoclonal cells, which is
essential in RTT, was determined by western blot with an antibody directed against acetylated
histone H3 at Lys9 (H3k9).
In summary, we have developed a cellular model for Rett Syndrome by using single cell-derived wild-type and mutant MECP2 expressing fibroblast clones with a common mutation
in MeCP2 (705delG). Furthermore, we were able to demonstrate a RETT-specific phenotype
in this model by investigating the hyperacetylation status and therefore it could serve as a cell
model for high throughput screening of therapeutic agents, diagnosis and personalized
treatment.
Keywords (eng)
Rett syndromeneurodevelopmental disorderMeCP2
Keywords (deu)
Rett Syndromneurologische EntwicklungsstörungMeCP2
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1395352
rdau:P60550 (deu)
72 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
72
Association (deu)
Title (eng)
Generation of clonal cell lines from fibroblasts of female RETT syndrome patients
Author
Melanie Rebecka Olczykowski
Abstract (deu)
Das Rett Syndrom (RTT) ist eine X-chromosomale neurologische Entwicklungsstörung, die
bei Kindern auftritt. Die Hauptursachen für diese Erkrankung sind Mutationen im Methyl-CpG-Bindungsprotein 2 (MECP2) Gen, welches für das Protein MeCP2 codiert und als
entscheidender Modulator der Genexpression fungiert. Um die Entwicklung von Therapien
für RTT voranzutreiben ist es notwendig, geeignete Zellmodelle zu etablieren.
Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, einzelne Zellklone aus den Fibroblasten eines Rett-Patienten zu isolieren und dadurch monoklonale Zellen von mutiertem und Wildtyp MeCP2
zu erhalten. Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Methoden verwendet und
verglichen: Durchflusszytometrie, Limiting Dilution Cloning und QIAscout™. Es wurden
zahlreiche Vereinzelungen durchgeführt; Klone wurden mit verschiedenen Medien behandelt,
die Zellen wurden immortalisiert und mittels Elektroporation mit dem Plasmid pCl neo-hEST2 transfiziert. Nach Erhalt der Klone wurden diese dann durch
Immunfluoreszenzfärbung, HUMARA-Assay und Sanger-Sequenzierung charakterisiert. Die
Ergebnisse zeigten einen Unterschied hinsichtlich verschiedener Behandlungen von Klonen
sowie Zellen, die mit und ohne Plasmid behandelt wurden. Schließlich wurde der Status der
Histonacetylierung in monoklonalen Zellen, der wesentlich beim RTT ist, mittels Western
Blot mit einem gegen acetylisiertes Histon H3 bei Lys9 (H3k9) gerichteten Antikörper
bestimmt.
Zusammenfassend haben wir ein zelluläres Modell für das Rett-Syndrom entwickelt, bei dem
aus Einzelzellen stammende Wildtyp- und mutierte MeCP2-exprimierende Fibroblastenklone
mit einer häufigen Mutation in MeCP2 (705delG) verwendet wurden. Darüber hinaus konnten
wir in diesem Modell einen RETT-spezifischen Phänotyp zeigen, in dem wir den
Hyperacetylierungsstatus untersuchten. Dieses Zellmodell könnte für das Hochdurchsatz-Screening von Therapeutika, sowie der Diagnostik und der personalisierten Behandlung
dienen.
Abstract (eng)
Mutations in the methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) gene which encodes the protein
MeCP2, a crucial modulator of gene expression, are the main cause of Rett Syndrome (RTT),
an X-linked neurodevelopmental disorder that appears in children. In order to advance the
development of therapies for RTT, the need to establish the appropriate cell models is
apparent.
It is hence the aim of this work to isolate single cells from a Rett patient’s fibroblasts and
ultimately obtain monoclonal cells such as mutant and wildtype MeCP2 clones. For this
purpose, three different methods were used and compared: Flow cytometry (FC), limiting
dilution cloning and QIAscout™. Numerous seedings were performed; clones were treated
with various mediums, cells were immortalized and transfected with the plasmid pCl neo-hEST2 via electroporation. Clones were obtained and then characterized by
immunofluorescence staining, the HUMARA assay and Sanger sequencing. Results showed a
difference between different treatments of clones as well as cells that were treated with and
without plasmid. Lastly, the status of histone hyperacetylation in monoclonal cells, which is
essential in RTT, was determined by western blot with an antibody directed against acetylated
histone H3 at Lys9 (H3k9).
In summary, we have developed a cellular model for Rett Syndrome by using single cell-derived wild-type and mutant MECP2 expressing fibroblast clones with a common mutation
in MeCP2 (705delG). Furthermore, we were able to demonstrate a RETT-specific phenotype
in this model by investigating the hyperacetylation status and therefore it could serve as a cell
model for high throughput screening of therapeutic agents, diagnosis and personalized
treatment.
Keywords (eng)
Rett syndromeneurodevelopmental disorderMeCP2
Keywords (deu)
Rett Syndromneurologische EntwicklungsstörungMeCP2
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1395353
Number of pages
72
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