Title (eng)
Multi-luciferase assay based characterization of geneticin-enriched transduced cells
Parallel title (deu)
Multi-Luciferase assay basierte Charakterisierung von mit Geneticin angereicherten transduzierten Zellen
Author
Julia Moldaschl
Advisor
Manfred Ogris
Co-Advisor
Haider Sami
Assessor
Manfred Ogris
Abstract (deu)
Die Entstehung von Krebs ist ein Prozess, der zahlreiche Parameter umfasst. Insbesondere mutierte oder fehlregulierte Signaltransduktionswege und sogenannte cancer initiating stem cells (CSC) spielen eine Schlüsselrolle in der Tumorprogression und der verminderten Ansprechbarkeit auf Chemotherapeutika. Untersuchungen des Zusammenspiels dieser bedeutenden Signalwege stellen einen vielversprechenden Ansatz für die Entwicklung neuer Wirkstoffe für die Krebstherapie dar. In diesem Kontext kommt den Signaltransduktionswegen Sonic Hedgehog, Notch und Wnt besondere Bedeutung an der Beteiligung der Krebsentstehung zu. Multiplexing in in-vitro-Versuchen und die Anwendung multipler Luciferase-Reporterplasmide können wichtige Instrumente für simultane Untersuchungen der Aktivitäten und Verstrickungen der erwähnten Signalwege in kanzerösen Zellen sein. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Charakterisierung humanen embryonaler Nierenzellen (HEK293T), welche stabil mit dem multiplem Luciferase-Reporterplasmid, „3P-Luc“, transduziert sind, genannt HEK293T 3P-Luc Zellen. Diese Zellen besitzen ein 3P-Luc DNA Element, welches für drei verschiedene Luciferasen codiert, namentlich Firefly Luciferase, Gaussia Luciferase and NanoLuc. Diese werden unter der Kontrolle von Promoterelementen exprimiert, welche jeweils von den Signalwegen Sonic Hedgehog, Notch und Wnt aktiviert werden. Das ermöglicht die simultane Untersuchung der Aktivität aller drei Signalwege. Mit dem 3P-Luc Plasmid transduzierte und mit Geneticin angereicherte HEK293T Zellen wurden hinsichtlich ihrer basalen Signalwegeaktivität mittels Multi-Luc/BCA Assay analysiert. Dies ist ein Multiplex-Experiment, welches drei verschiedene Assays basierend auf Luciferasen und einen BCA Assay für die Proteinnormierung kombiniert. HEK293T 3P-Luc Zellen wurden auch hinsichtlich ihrer EGPF-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert, da das 3P-Luc DNA-Element das Gen für grün fluoreszierendes Protein (EGFP) unter konstitutiver Expression enthält. Zusätzlich wurden Nanocarrier-basierte Transfektionen mit Signalweg-induzierenden Plasmiden in HEK293T 3P-Luc Zellen durchgeführt, um die Ansprechbarkeit dieser Zellen hinsichtlich Signalweg-Modulatoren zu überprüfen.
Abstract (eng)
The formation of cancer is a process involving multiple parameters. In particular, mutated or dysregulated signal transduction pathways and cancer initiating stem cells play a key role in cancer progression and reduced responsiveness to chemotherapeutics. Investigations of the interplay of these substantial pathways offer a promising approach for the development of novel therapeutics for cancer treatment. Placed in this context, the signal transduction pathways Sonic Hedgehog, Notch and Wnt are quite important for their participation in tumorigenesis. Multiplexing applied within in-vitro assays and the use of multi-luciferase reporter plasmids may act as important methods for simultaneously examining the activity and cross-talk of the mentioned pathways in cancerous cells.
The focus of this thesis is on characterization of human embryonic kidney cells (HEK293T) stably transduced with the multi-luciferase reporter plasmid “3P-Luc” i.e. HEK293T 3P-Luc cells. These cells possess the 3P-Luc DNA, which encodes for three different luciferases, namely Firefly luciferase, Gaussia luciferase and NanoLuc. These are expressed under the control of promoter elements responsive to the Sonic Hedgehog, Notch and Wnt pathway, respectively. This enables studying activity of all three specific networks simultaneously. 3P-Luc transduced and geneticin-enriched HEK293T cells were analyzed for basal pathway activity by employing the Multi-Luc/BCA assay. This is a multiplexing experiment combining three different luciferase assays and one BCA assay for protein normalization. HEK293T 3P-Luc cells were also characterized for green fluorescent protein (EGFP) expression by flow cytometry studies as the 3P-Luc element also contains the EGFP gene under constitutive expression. In addition, nanocarrier based transfections with pathway inducer plasmids were performed in HEK293T 3P-Luc cells to check the responsiveness of these cells for pathway modulators.
Keywords (eng)
multi-luciferase assayHEK293T3P-Luc plasmid
Keywords (deu)
Multi-luciferase AssayHEK293T3P-Luc Plasmid
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1398510
rdau:P60550 (deu)
91 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
91
Association (deu)
Title (eng)
Multi-luciferase assay based characterization of geneticin-enriched transduced cells
Parallel title (deu)
Multi-Luciferase assay basierte Charakterisierung von mit Geneticin angereicherten transduzierten Zellen
Author
Julia Moldaschl
Abstract (deu)
Die Entstehung von Krebs ist ein Prozess, der zahlreiche Parameter umfasst. Insbesondere mutierte oder fehlregulierte Signaltransduktionswege und sogenannte cancer initiating stem cells (CSC) spielen eine Schlüsselrolle in der Tumorprogression und der verminderten Ansprechbarkeit auf Chemotherapeutika. Untersuchungen des Zusammenspiels dieser bedeutenden Signalwege stellen einen vielversprechenden Ansatz für die Entwicklung neuer Wirkstoffe für die Krebstherapie dar. In diesem Kontext kommt den Signaltransduktionswegen Sonic Hedgehog, Notch und Wnt besondere Bedeutung an der Beteiligung der Krebsentstehung zu. Multiplexing in in-vitro-Versuchen und die Anwendung multipler Luciferase-Reporterplasmide können wichtige Instrumente für simultane Untersuchungen der Aktivitäten und Verstrickungen der erwähnten Signalwege in kanzerösen Zellen sein. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Charakterisierung humanen embryonaler Nierenzellen (HEK293T), welche stabil mit dem multiplem Luciferase-Reporterplasmid, „3P-Luc“, transduziert sind, genannt HEK293T 3P-Luc Zellen. Diese Zellen besitzen ein 3P-Luc DNA Element, welches für drei verschiedene Luciferasen codiert, namentlich Firefly Luciferase, Gaussia Luciferase and NanoLuc. Diese werden unter der Kontrolle von Promoterelementen exprimiert, welche jeweils von den Signalwegen Sonic Hedgehog, Notch und Wnt aktiviert werden. Das ermöglicht die simultane Untersuchung der Aktivität aller drei Signalwege. Mit dem 3P-Luc Plasmid transduzierte und mit Geneticin angereicherte HEK293T Zellen wurden hinsichtlich ihrer basalen Signalwegeaktivität mittels Multi-Luc/BCA Assay analysiert. Dies ist ein Multiplex-Experiment, welches drei verschiedene Assays basierend auf Luciferasen und einen BCA Assay für die Proteinnormierung kombiniert. HEK293T 3P-Luc Zellen wurden auch hinsichtlich ihrer EGPF-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert, da das 3P-Luc DNA-Element das Gen für grün fluoreszierendes Protein (EGFP) unter konstitutiver Expression enthält. Zusätzlich wurden Nanocarrier-basierte Transfektionen mit Signalweg-induzierenden Plasmiden in HEK293T 3P-Luc Zellen durchgeführt, um die Ansprechbarkeit dieser Zellen hinsichtlich Signalweg-Modulatoren zu überprüfen.
Abstract (eng)
The formation of cancer is a process involving multiple parameters. In particular, mutated or dysregulated signal transduction pathways and cancer initiating stem cells play a key role in cancer progression and reduced responsiveness to chemotherapeutics. Investigations of the interplay of these substantial pathways offer a promising approach for the development of novel therapeutics for cancer treatment. Placed in this context, the signal transduction pathways Sonic Hedgehog, Notch and Wnt are quite important for their participation in tumorigenesis. Multiplexing applied within in-vitro assays and the use of multi-luciferase reporter plasmids may act as important methods for simultaneously examining the activity and cross-talk of the mentioned pathways in cancerous cells.
The focus of this thesis is on characterization of human embryonic kidney cells (HEK293T) stably transduced with the multi-luciferase reporter plasmid “3P-Luc” i.e. HEK293T 3P-Luc cells. These cells possess the 3P-Luc DNA, which encodes for three different luciferases, namely Firefly luciferase, Gaussia luciferase and NanoLuc. These are expressed under the control of promoter elements responsive to the Sonic Hedgehog, Notch and Wnt pathway, respectively. This enables studying activity of all three specific networks simultaneously. 3P-Luc transduced and geneticin-enriched HEK293T cells were analyzed for basal pathway activity by employing the Multi-Luc/BCA assay. This is a multiplexing experiment combining three different luciferase assays and one BCA assay for protein normalization. HEK293T 3P-Luc cells were also characterized for green fluorescent protein (EGFP) expression by flow cytometry studies as the 3P-Luc element also contains the EGFP gene under constitutive expression. In addition, nanocarrier based transfections with pathway inducer plasmids were performed in HEK293T 3P-Luc cells to check the responsiveness of these cells for pathway modulators.
Keywords (eng)
multi-luciferase assayHEK293T3P-Luc plasmid
Keywords (deu)
Multi-luciferase AssayHEK293T3P-Luc Plasmid
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1398511
Number of pages
91
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