Title (eng)
Discovery of natural products from Actinobacteria via genome mining
Parallel title (deu)
Entdeckung von Naturstoffen aus Actinobakterien mit Hilfe der Genomanalytik
Author
Sonali Makarand Vaidya
Advisor
Sergey Zotchev
Co-Advisor
Olha Schneider
Assessor
Sergey Zotchev
Abstract (deu)
Aufgrund der steigenden Zahlen von Erkrankungen, die von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen verursacht werden, ist die Entwicklung der antimikrobieller Mittel von großer Bedeutung. Pflanzen und Mikroorganismen sind bereits bewiesene Quellen für natürliche bioaktive Stoffe. Mit der Fortschritten in der Weiterentwicklung von der Sequenzierungsmethoden wurde das verborgene Potenzial von Aktinobakterien als Produzenten der bioaktiven Naturstoffen aufgedeckt. Die Analyse der Genomsequenzierungsdaten zeigte, dass die Vertreter der Abteilung von Aktitobacteria eine Reihe von biosynthetischen Cluster tragen, deren Produkt während einer Kultivierung im Labor noch nie nachgewiesen werden konnte.
Im Rahmen dieses Projekts wurden Experimente mit zwei BGCs aus Streptomyces bambergiensis durchgeführt. In-silico-Analysen mit bioinformatischen Tools wie antiSMASH und BLAST ergaben, dass BGC 18 und BGC 20 für die Produktion vielversprechender neuen bioaktiven Verbindungen zuständig sein könnten. Als Ausgangspunk für diese Arbeit war ein Screening von E. coli-Klonen, die genomische DNA von Streptomyces bambergiensis tragen. Mit molekularbiologischen Techniken wurde die DNA aus den E. coli-Klonen extrahiert und anschließend für weitere Schritte kloniert. Um Zugang zu den angeblichen bioaktiven Verbindungen zu erhalten, wurden beide BGCs durch homologe Rekombination in Hefe mit Hilfe der TAR-Methode in den Shuttle-Vektor pCLY10 kloniert. Anschließend war eine heterologe Expression in verschiedenen Streptomyces heterologen Stämmen geplant. Basiert auf den Ergebnissen von dieser Arbeit, es konnten die Hinweise auf eine Instabilität von dem pCLY10 Vektorsystem erhaltet werden. Auch wenn die PCR-Analyse ergab den Nachweis von einer erfolgsreicher Assembly in Hefe, die Übertragung von dem cluster-tragenden Vektor zu E. coli und Streptomyces spp. war nicht erfolgsreich, und es müssen weitere Alternativen für eine Optimierung des Protokolls durchgeführt werden.
Der zweite Teil dieser Masterarbeit befasste sich mit den BGC 3 und 4 von Actinoalloteichus fjordicus DSM 46856, der aus dem Meeresschwamm Geodia barretti isoliert wurde, der im Trondheim-Fjord in Norwegen gesammelt wurde. Die BGCs wurden bereits erfolgreich in Hefe assembliert und das regulatorische SARP-Gen wurde in den Vektor pUWLoriT kloniert und weiter transferiert in die Stämme Streptomyces coelicolor M1154 und Streptomyces albus J1074. Zur Produktion von Sekundärmetaboliten wurde eine Fermentation in verschiedenen Medien durchgeführt. Der Extrakt aus diesen Kulturen wurde mittels analytischer HPLC und MS bewertet. Gleichzeitig wurde die Bioaktivität der Extrakte getestet, um möglicherweise Produktion von antibakteriellen Stoffen gegen verschiedene Testorganismen nachzuweisen.
Zusammenfassend lieferte diese Arbeit wichtige Hinweise auf eine Instabilität des breitverwendbaren pCLY10-Vektors für die heterologe Expression der biosynthetischen Genclusters. Auch wenn im Rahmen dieses Projekt eine erfolgsreiche Produktion der gewünschten Stoffen nicht erzielt werden konnte, bitten experimentell erzeugte Ergebnisse ein Basis für weitere Forschung an der Verbesserung der biosynthetischen Gencluster-Expression und entsprechend Naturstoffbiosynthesis.
Abstract (eng)
The discovery of novel antimicrobials is a pressing priority to address the rising problem of pathogens causing infections in humans and becoming resistant due to the frequent use of currently available antibiotics. Plants and microorganisms have already been proven as sources of natural bioactive compounds. Advances in genome sequencing have unravelled the presence of silent Biosynthetic Gene Clusters (BGCs) in microorganisms, especially Actinobacteria and their activation could lead to the discovery of bioactive secondary metabolites which potentially may become new drug candidates.
During this project, experiments were performed on two BGCs from Streptomyces bambergiensis. In-silico analysis using bioinformatics tools like antiSMASH and BLAST suggested that BGC 18 and BGC 20 encode for potentially novel natural products. After initial pooled-PCR-based library screening of E. coli clones harbouring Streptomyces bambergiensis genome fragments, clones encoding BGC 18 and 20 were identified. Molecular biology techniques were used to extract the DNA from E. coli clones and subsequently genetically manipulate it. To gain an access to the putative bioactive compounds, both BGCs were assembled into the shuttle vector pCLY10 utilizing homologous recombination in yeast using the TAR method. Subsequently, heterologous expression was planned in different engineered Streptomyces host strains. However, stability of the cluster-carrying vector in E. coli and Streptomyces spp. during horizontal gene transfer was compromised and more experiments need to be performed to ensure successful conjugation of BGC into engineered Streptomyces host.
The second part of this master thesis work involved working on BGC 3 and 4 of Actinoalloteichus fjordicus DSM 46856 which was isolated from a marine sponge Geodia barretti collected at the Trondheim fjord in Norway. The BGCs were already successfully assembled in yeast in the previous work and regulatory gene SARP was cloned into multi-copy pUWLoriT vector during this project. The goal was to carry out conjugation in Streptomyces coelicolor M1154 [1] and Streptomyces albus J1074 [2]. For the production of secondary metabolites, fermentations in different media were carried out. The extract of secondary metabolites from these cultures was evaluated by analytical HPLC and LC-MS. Simultaneously, disc diffusion assays were performed to possibly demonstrate their activity against various test organisms.
We got a research foundation despite of not being able to meet our ultimate goal. It can be assumed that the system used to clone BGC has indefinite stability and that alternative shuttle vectors for cloning large BGCs is therefore necessary.
Keywords (eng)
genome miningactinobacteriacloningbiosynthetic gene clusterssecondary metabolitessilent BGCsnatural product drug discoverymolecular biologyheterologous expression
Keywords (deu)
Genom-MiningActinobakterienKlonenbiosynthetische GenclusterSekundärmetabolitenstille BGCsEntdeckung von Naturstoff-MedikamentenMolekularbiologieheterologe Expression
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1399228
rdau:P60550 (deu)
96 Seiten : Illustrationen
Number of pages
97
Association (deu)
Title (eng)
Discovery of natural products from Actinobacteria via genome mining
Parallel title (deu)
Entdeckung von Naturstoffen aus Actinobakterien mit Hilfe der Genomanalytik
Author
Sonali Makarand Vaidya
Abstract (deu)
Aufgrund der steigenden Zahlen von Erkrankungen, die von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen verursacht werden, ist die Entwicklung der antimikrobieller Mittel von großer Bedeutung. Pflanzen und Mikroorganismen sind bereits bewiesene Quellen für natürliche bioaktive Stoffe. Mit der Fortschritten in der Weiterentwicklung von der Sequenzierungsmethoden wurde das verborgene Potenzial von Aktinobakterien als Produzenten der bioaktiven Naturstoffen aufgedeckt. Die Analyse der Genomsequenzierungsdaten zeigte, dass die Vertreter der Abteilung von Aktitobacteria eine Reihe von biosynthetischen Cluster tragen, deren Produkt während einer Kultivierung im Labor noch nie nachgewiesen werden konnte.
Im Rahmen dieses Projekts wurden Experimente mit zwei BGCs aus Streptomyces bambergiensis durchgeführt. In-silico-Analysen mit bioinformatischen Tools wie antiSMASH und BLAST ergaben, dass BGC 18 und BGC 20 für die Produktion vielversprechender neuen bioaktiven Verbindungen zuständig sein könnten. Als Ausgangspunk für diese Arbeit war ein Screening von E. coli-Klonen, die genomische DNA von Streptomyces bambergiensis tragen. Mit molekularbiologischen Techniken wurde die DNA aus den E. coli-Klonen extrahiert und anschließend für weitere Schritte kloniert. Um Zugang zu den angeblichen bioaktiven Verbindungen zu erhalten, wurden beide BGCs durch homologe Rekombination in Hefe mit Hilfe der TAR-Methode in den Shuttle-Vektor pCLY10 kloniert. Anschließend war eine heterologe Expression in verschiedenen Streptomyces heterologen Stämmen geplant. Basiert auf den Ergebnissen von dieser Arbeit, es konnten die Hinweise auf eine Instabilität von dem pCLY10 Vektorsystem erhaltet werden. Auch wenn die PCR-Analyse ergab den Nachweis von einer erfolgsreicher Assembly in Hefe, die Übertragung von dem cluster-tragenden Vektor zu E. coli und Streptomyces spp. war nicht erfolgsreich, und es müssen weitere Alternativen für eine Optimierung des Protokolls durchgeführt werden.
Der zweite Teil dieser Masterarbeit befasste sich mit den BGC 3 und 4 von Actinoalloteichus fjordicus DSM 46856, der aus dem Meeresschwamm Geodia barretti isoliert wurde, der im Trondheim-Fjord in Norwegen gesammelt wurde. Die BGCs wurden bereits erfolgreich in Hefe assembliert und das regulatorische SARP-Gen wurde in den Vektor pUWLoriT kloniert und weiter transferiert in die Stämme Streptomyces coelicolor M1154 und Streptomyces albus J1074. Zur Produktion von Sekundärmetaboliten wurde eine Fermentation in verschiedenen Medien durchgeführt. Der Extrakt aus diesen Kulturen wurde mittels analytischer HPLC und MS bewertet. Gleichzeitig wurde die Bioaktivität der Extrakte getestet, um möglicherweise Produktion von antibakteriellen Stoffen gegen verschiedene Testorganismen nachzuweisen.
Zusammenfassend lieferte diese Arbeit wichtige Hinweise auf eine Instabilität des breitverwendbaren pCLY10-Vektors für die heterologe Expression der biosynthetischen Genclusters. Auch wenn im Rahmen dieses Projekt eine erfolgsreiche Produktion der gewünschten Stoffen nicht erzielt werden konnte, bitten experimentell erzeugte Ergebnisse ein Basis für weitere Forschung an der Verbesserung der biosynthetischen Gencluster-Expression und entsprechend Naturstoffbiosynthesis.
Abstract (eng)
The discovery of novel antimicrobials is a pressing priority to address the rising problem of pathogens causing infections in humans and becoming resistant due to the frequent use of currently available antibiotics. Plants and microorganisms have already been proven as sources of natural bioactive compounds. Advances in genome sequencing have unravelled the presence of silent Biosynthetic Gene Clusters (BGCs) in microorganisms, especially Actinobacteria and their activation could lead to the discovery of bioactive secondary metabolites which potentially may become new drug candidates.
During this project, experiments were performed on two BGCs from Streptomyces bambergiensis. In-silico analysis using bioinformatics tools like antiSMASH and BLAST suggested that BGC 18 and BGC 20 encode for potentially novel natural products. After initial pooled-PCR-based library screening of E. coli clones harbouring Streptomyces bambergiensis genome fragments, clones encoding BGC 18 and 20 were identified. Molecular biology techniques were used to extract the DNA from E. coli clones and subsequently genetically manipulate it. To gain an access to the putative bioactive compounds, both BGCs were assembled into the shuttle vector pCLY10 utilizing homologous recombination in yeast using the TAR method. Subsequently, heterologous expression was planned in different engineered Streptomyces host strains. However, stability of the cluster-carrying vector in E. coli and Streptomyces spp. during horizontal gene transfer was compromised and more experiments need to be performed to ensure successful conjugation of BGC into engineered Streptomyces host.
The second part of this master thesis work involved working on BGC 3 and 4 of Actinoalloteichus fjordicus DSM 46856 which was isolated from a marine sponge Geodia barretti collected at the Trondheim fjord in Norway. The BGCs were already successfully assembled in yeast in the previous work and regulatory gene SARP was cloned into multi-copy pUWLoriT vector during this project. The goal was to carry out conjugation in Streptomyces coelicolor M1154 [1] and Streptomyces albus J1074 [2]. For the production of secondary metabolites, fermentations in different media were carried out. The extract of secondary metabolites from these cultures was evaluated by analytical HPLC and LC-MS. Simultaneously, disc diffusion assays were performed to possibly demonstrate their activity against various test organisms.
We got a research foundation despite of not being able to meet our ultimate goal. It can be assumed that the system used to clone BGC has indefinite stability and that alternative shuttle vectors for cloning large BGCs is therefore necessary.
Keywords (eng)
genome miningactinobacteriacloningbiosynthetic gene clusterssecondary metabolitessilent BGCsnatural product drug discoverymolecular biologyheterologous expression
Keywords (deu)
Genom-MiningActinobakterienKlonenbiosynthetische GenclusterSekundärmetabolitenstille BGCsEntdeckung von Naturstoff-MedikamentenMolekularbiologieheterologe Expression
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
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https://phaidra.univie.ac.at/o:1399229
Number of pages
97
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