Standardization and harmonization in lipidomics

Harald Schöny

doi:10.25365/thesis.74983

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1401239

Title (eng)

Standardization and harmonization in lipidomics

Parallel title (eng)

Parallel title (deu)

Standardisierung und Harmonisierung in der Lipidomik

Author

Harald Schöny

Advisor

Gunda Köllensperger

Assessor

Michael Lämmerhofer

Gerhard Liebisch

Abstract (deu)

Lipidomics, die biochemische Wissenschaft die sich mit der Untersuchung von Lipiden und deren Stoffwechselwege beschäftigt, steht seit einigen Jahren im Fokus vieler Forschungen, da die zentrale Funktion von Lipiden in vielen Bereichen eine Rolle spielt. Die Analyse dieser Verbindungen ist allerdings oft eine Herausforderung, speziell bei der Quantifizierung mittels Massenspektrometrie (MS). Nur die Verwendung von geeigneten Standards kann mögliche Fehlerquellen vermeiden und isotopenmarkierte interne Standards (ISTD) gelten hierbei als „Goldstandard“ für genaue und reproduzierbare Quantifizierung. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich daher mit der Implementierung von „lipidome isotope labeling of yeast“ (LILY) für die Quantifizierung von Lipiden. Dabei wurde ein in vivo 13C markiertes Pichia pastoris Hefe Lipidome als kostengünstige ISTD Alternative in einen neuartigen vollautomatisierten Workflow integriert. Mittels Fließinjektion wurde der LILY ISTD on-Demand quantifiziert und anschließend bei der Probenanalyse mittels Umkehrphasen-Flüssigchromatographie angewendet. Dadurch ist eine große Abdeckung von Spezies-spezifischen und/ oder Retentionszeit angepassten Klassen-spezifischen Kalibratoren möglich, was eine genaue absolute Quantifizierung für viele Lipid-Analyten garantiert. Die Unabhängigkeit von herkömmlichen kommerziellen deuterierten und nicht-endogenen ISTDs eröffnet außerdem eine Vergleichsprüfung für unterschiedliche organische MS Methoden. Im zweiten Teil wurden verschiedene Quantifizierungsmöglichkeiten vergleichsgeprüft, um eine rückverfolgbare Lipidklassenquantifizierung der Hefe zu garantieren. Klassische MS Lipidomics Methoden wie Shotgun Lipidomics und Chromatographie-basierte Methoden wurden mit alternativen Methoden wie der Kernresonanzspektrometrie (engl. NMR) oder der induktiv gekuppelten Plasma-MS verglichen und validiert. Für sieben verschiedene Lipidklassen konnten dadurch rückverfolgbare absolute Konzentrationen bestimmt werden. Da für Lipidomics Methoden noch keine zertifizierten Referenzmaterialien vorhanden sind, ist dies ein wichtiger Schritt in Richtung Standardisierung und Harmonisierung. Im letzten Teil sollte der Hefe-basierte ISTD weiter optimiert werden. Um mögliche Unterschiede zwischen ISTD und Probe fallspezifisch adaptieren zu können, wurde eine Fraktionierung des Lipidomes in die einzelnen Lipidklassen durch semi-präparative überkritische Fluidchromatographie (engl. SFC) ermöglicht. Diese Methode bietet den Vorteil sowohl neutrale als auch polare Lipide in nur 26 min zu trennen. Durch das besser aufgetrennte und angereicherte Lipidome konnten 400 Lipide in Pichia pastoris identifiziert werden, die nach Bedürfnis in ihrer Konzentration und Zusammensetzung wieder verändert zusammengefügt werden können.

Abstract (eng)

Lipidomics, which aims to study pathways and networks of cellular lipids in biological systems, is a continuously growing research field. Several analytical challenges accumulate especially in quantitative analysis by mass spectrometry (MS). Only suitable standardization can overcome its limitations and isotopically labeled internal standards (ISTD) are without question the “Gold Standard” for accurate and reproducible quantification. Within the first part of this thesis, the implementation of a quantification method based on lipidome isotope labeling of yeast (LILY), an in vivo 13C labeled Pichia pastoris yeast lipidome, as ISTD showed the potential of this cost-saving ISTD alternative. A novel fully automated workflow for lipidomics based on flow injection (FI), followed by reversed-phase- liquid chromatography-high resolution MS (RP-LC–HRMS) achieved absolute quantification of the sample lipidome by using a large set of species-specific and/or retention time-matched, class-specific calibrants. Due to the independence of the quantitative values from common deuterated or non-endogenous ISTDs, the novel workflow offered cross-validation of different organic MS-based lipid methods. The second part cross-validated lipid class concentrations via multiple quantification platforms including common lipidomics workflows but also alternative approaches such as nuclear magnetic resonance (NMR) and inductively coupled plasma (ICP). Quantitative values for seven different polar lipid classes enabled traceable absolute lipid class concentrations, which are rare in a field without certified reference materials. The final part further tried to optimize the use of yeast-based ISTD by fractionating the lipidome in its lipid classes via semi-preparative supercritical fluid chromatography (SFC). This powerful tool offered separation of a wide polarity range covering neutral and polar lipids in one 26 min run. The workflow doubled the identified lipids in Pichia pastoris to 400, due to the enriched and purified fractions and enabled concentration and composition adoptions of LILY to the sample of interest.

Keywords (deu)

LipidomikQuantifizierungInterner StandardLipidklassentrennungStandardisierung

Keywords (eng)

LipidomicsQuantificationInternal standardLipid class separationStandardisation

Subject (deu)

Analytische Chemie: Allgemeines

Subject (deu)

Lipide

Type (deu)

Dissertation

Persistent identifier

https://phaidra.univie.ac.at/o:1401239