Changes within the T-cell receptor-CD3 complex quaternary structure upon T-cell activation

Lisa-Maria Wurm

doi:10.25365/thesis.71995

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1543273

Title (eng)

Changes within the T-cell receptor-CD3 complex quaternary structure upon T-cell activation

Parallel title (deu)

Änderungen der T-Zell Rezeptor-CD3 Komplex Quartärstruktur in Folge von T-Zell Aktivierung

Author

Lisa-Maria Wurm

Advisor

Johannes Huppa

Assessor

Johannes Huppa

Abstract (deu)

T-Helfer-Zellen sind essentieller Bestandteil der adaptiven Immunantwort. Sie reagieren auf Peptidantigene die ihnen mittels Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) einer Antigen präsentierenden Zelle (APC) unterbreitet werden, auf hoch sensitive wie auch spezifische Art und Weise. All das während sie immernoch fähig sind Selbstantigene zu tolerieren. Eine zentrale Rolle in der Antigenerkennung spielt der aus mehreren Untereinheiten bestehende T-Zell Rezeptor (TCR)-Komplex. Das als Antwort auf Fremdantigen vom TCR-Komplex generierte Signal moduliert die zelluläre Immunantwort und gilt daher als Schlüsselpunkt in der Pathogenabwehr. Trotzdem sind die Mechanismen die der TCR proximalen Signaltransduktion durch die Plasmamembrane hindurch zugrunde liegen weitgehend ungeklärt. Diese Arbeit liefert Hinweise auf Intermolekülbewegung innerhalb des TCR-Komplexes, die aus der Konfrontation mit stimulierenden Peptiden im MHC hervorgehen. Durch Erweiterung der im Labor von Johannes Huppa etablierten Methode der Super Resolution Mikroskopie konnte ich das beobachtete Ereignis den ersten Sekunden nach Antigen-Konfrontation zuordnen und weiters der Rekrutierung sekundärer Botenstoffe voranstellen. Um die Untereinheiten des TCR ortsspezifisch zu markieren, verwenden wir Antikörperfragment (scFv) sondern im Zuge einer Förster- Resonanzenergietransfer (FRET) basierten Analyse. Damit könen wir inter- und intramolekulare Distanzänderungen beobachten, während lebenden T-Zellen peptidbeladene MHC Moleküle auf einer funktionalisierten glasgestützten Doppellipidschicht, welche als APC Surrogat fungiert, aussetzen. Um die TCR-MHC Bindung zu synchronisieren, erweitern wir das System mit einer Maskierungseinheit, welche durch ultraviolettes Licht abspaltbar ist. Wir können somit die molekularen Dynamiken innerhalb der Zielzelle in Echtzeit verfolgen, während TCR und MHC in Verbindung gehen. Um diese Ergebnisse ausführlich zu evaluieren und die verwendeten Methode zu charakterisiert beziehen sich auch Teile dieser Arbeit darauf, das FRET Signal von ungewollten Nebeneffekten zu entkoppeln sowie die Limitierungen der unterschiedlichen Bildgebungsverfahren zu diskutieren.

Abstract (eng)

T-helper-cells are mediators of the adaptive immune response. They react to antigenic peptides that are presented to them via the Major Histocompatibility Complex (MHC) of an antigen-presenting cell (APC) in a highly sensitive and specific manner. All that while being able to tolerate “self”. Central to antigen recognition is the cells multisubunit T-cell antigen receptor (TCR)-complex. The signal, created by the TCR-complex in response to foreign antigens, modulates cellular immune response and is therefore a pivotal step in host defense. Still, mechanisms underlying TCR proximal signal transduction across the plasma membrane are yet to be determined. This work provides evidence for intermolecular movement within the TCR-complex as a result of cognate peptide MHC binding. Extending the super-resolution microscopy method established by the lab of Johannes Huppa allowed me to temporally define the observed event as occupying the first seconds post antigen exposure and even prior to signaling protein recruitment to the complex. We used small fluorophore conjugated single chain antibody fragment (scFv) probes to site-specifically label the TCR subunits in a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-based assay. This way we were able to observe changes in inter- and intramolecular distances, when confronting live T-cells with a peptide-loaded MHC on a functionalized glass supported lipid bilayer acting as an APC surrogate. To synchronize MHC-TCR binding, we introduced a UV-cleavable caging entity to the system. This allows real-time monitoring of mole¬¬cular dynamics within the target cell during TCR-MHC engagement. To properly evaluate the findings and characterize the method used, parts of this work are devoted to uncouple the FRET signal from bystander effects as well as discussing limitations of the different imaging approaches I undertook throughout my work.

Keywords (deu)

T-Zell RezeptorDistanzänderungFRETTCRsuperauflösende Mikroskopie

Keywords (eng)

T-Cell ReceptorChange in DistanceFRETTCRSuperresolution Microscopy

Subject (deu)

Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

Subject (deu)

Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

Subject (deu)

Optik

Type (deu)

Masterarbeit