Combinatory effects of mycoestrogens and isoflavones

Rebeka Früholz

doi:10.25365/thesis.72531

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1604054

Title (eng)

Combinatory effects of mycoestrogens and isoflavones

Author

Rebeka Früholz

Advisor

Doris Marko

Co-Advisor

Elisabeth Varga

Assessor

Doris Marko

Abstract (deu)

Mykotoxine gelten als pilzliche Stoffwechselprodukte mit einem breiten Spektrum an Eigenschaften und toxikologischen Eigenschaften. Zearalenon (ZEN) wird als eine Art Mykotoxin klassifiziert, das von verschiedenen Fusarium-Arten produziert wird und häufig landwirtschaftliche Produkte wie Mais und Soja kontaminiert. Häufig gefundene Metaboliten von ZEN sind a-Zearalanol (a-ZAL), Zearalenon-14-sulfat (ZEN-14-S) oder a-Zearalenol (a- ZEL), wobei in dieser Arbeit die ersten beiden neben ZEN untersucht wurden. Isoflavone wie Daidzein (DAI), Genistein (GEN) und Glycitein (GLY) sind sekundäre Pflanzenstoffe, die hauptsächlich in Soja und Sojaprodukten vorkommen. Equol (EQ) ist ein bakterieller Metabolit von DAI, wird jedoch aufgrund seiner ähnlichen Eigenschaften häufig mit den zuvor genannten Isoflavonen in Verbindung gebracht. Es wurde festgestellt, dass ZEN und die Isoflavone Östrogene Verbindungen sind, da ihre strukturelle Ähnlichkeit mit 17b-Estradiol die Bindung an entsprechende Östrogenrezeptoren (ERs) ermöglicht und somit die Aktivierung einer Reihe von östrogenabhängigen Signalwegen auslöst. Die Relevanz des gleichzeitigen Vorkommens von Isoflavonen, ZEN und ZEN-Metaboliten in Lebens- und Futtermitteln stellt das Hauptziel dieser Untersuchung dar, wobei der Schwerpunkt auf einem möglichen Synergismus aufgrund der strukturellen Ähnlichkeiten der Verbindungen liegt. In dieser Arbeit wurden die Zytotoxizitätsassays Cell Titer Blue (CTB) und Sulforhodamine B (SRB) eingesetzt, um das zytotoxische Potential der Isoflavone, ZEN und ZEN-Metaboliten als Einzelsubstanzen und als binäre Kombinationen zu untersuchen. Beide Assays wurden an Ishikawa-Zellen mit einer Inkubationsdauer von 48 Stunden durchgeführt. Für DAI, GEN und EQ wurden Konzentrationen im Bereich von 0,001–10 μM angewendet, während die ZEN- und ZEN-Metabolitenkonzentrationen im Bereich von 0,001–10 nM lagen. Für GLY wurden Konzentrationen von 0,01–20 μM verwendet. Darüber hinaus wurde quantitative Echtzeit- Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) verwendet, um die Rolle von CYP1A1, CYP1B1, ESR1 und ESR2 bei der Metabolisierung von GEN und ZEN in hohen Konzentrationen (1–10 μM bzw. 1– 10 nM) zu bestimmen). Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays ergaben kein zytotoxisches Potenzial der angewendeten Kombinationen oder der Einzelsubstanzen. Die beobachtete Zytotoxizität erreichte in keinem der durchgeführten Experimente weniger als 80 % im Vergleich zur Kontrolle. Andererseits wurde bei bestimmten Kombinationen mit einem Maximum von 128% bei 10 nM a-ZAL und 1 μM DAI ein leichtes proliferatives Potential suggeriert. Da diese Untersuchungen jedoch nicht darauf ausgerichtet waren, das proliferative Potenzial zu untersuchen, sind die Schlussfolgerungen begrenzt. Die RT-PCR-Ergebnisse wurden von hohen Standardabweichungen überschattet, was auch hier die endgültigen Aussagen zur Rolle der ausgewählten Gene einschränkte. Weitere Forschung ist notwendig, um die Mechanismen aufzuklären, die bei hohen Konzentrationen von Isoflavonen in Kombination mit ZEN und seinen Metaboliten beteiligt sind. Als abschließende Bemerkung stärkt diese Arbeit vorherige Untersuchungen, indem sie das zytotoxische Potenzial der untersuchten Verbindungen bei den physiologisch relevanten Konzentrationen ausschließt. Das gleichzeitige Vorkommen von Isoflavonen, ZEN und ZEN- Metaboliten stellt ein dringendes Problem dar, das weitere Versuche benötigt, da ähnliche Wirkungsweisen Anlass zu synergistischen Wirkungsweisen geben. Monotone landwirtschaftliche Futtermittel, die größtenteils aus Soja und Mais bestehen, stellen ideale Szenarien für verstärkte toxikologische Wirkweisen dar und liefern ein Beispiel dafür, wo die Betrachtung der Einzelstofftoxizität möglicherweise nicht ausreicht.

Abstract (eng)

Mycotoxins are considered to be fungal metabolites with a broad spectrum of characteristics and toxicological properties. Zearalenone (ZEN) classifies as a type of mycotoxin, being produced by various Fusarium species, frequently contaminating agricultural products such as corn and soy. Commonly found metabolites of ZEN are a-zearalanol (a-ZAL), zearalenone- 14-sulfate (ZEN-14-S) or a-zearalenol (a-ZEL), where in this thesis the first two were investigated alongside of ZEN. Isoflavones such as daidzein (DAI), genistein (GEN), and glycitein (GLY), are secondary plant metabolites, mainly found in soy and soy product. Equol (EQ) is a bacterial metabolite of DAI, yet is frequently affiliated with the previously named isoflavones due to its similar properties. ZEN and the isoflavones are found to be estrogenic compounds as their structural similarity to 17b-estradiol allows binding to respective estrogen receptors (ERs) and hence triggers activation of a series of estrogen-dependent pathways. The relevance of co-occurrence of isoflavones, ZEN, and ZEN metabolites in food and feed products represents the main objective of this investigation with focus on possible synergism due to the structural resemblances of the compounds. In this thesis the cytotoxicity assays Cell Titer Blue (CTB) and sulforhodamine B (SRB) were applied in order to investigate the cytotoxic potential of the isoflavones, ZEN, and ZEN metabolites as single substances and as binary combinations. Both assays were performed on Ishikawa cells with an incubation duration of 48 hours. For DAI, GEN, and EQ concentrations ranging from 0.001-10 μM were applied whereas the ZEN and ZEN metabolite concentrations ranged from 0.001–10 nM. For GLY concentrations of 0.01–20 μM were used. Furthermore, quantitative real-time reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was utilized to determine the role of CYP1A1, CYP1B1, ESR1, and ESR2 in the metabolization of GEN and ZEN at high concentrations (1–10 μM and 1–10 nM respectively). The results of the cytotoxicity assays concluded no cytotoxic potential of any of the applied combinations or as single substances. The observed cytotoxicity did not reach below 80% compared to the control in any of the conducted experiments. On the other hand, slight proliferative potential was suggested at certain combinations with a maximum of 128% at 10 nM of α-ZAL and 1 μM of DAI. However, as these investigations were not set up to assay proliferative potential, conclusions are limited. The RT-PCR results were overshadowed by high standard deviations, here too limiting final statements concerning the role of the selected genes. Further research would be necessary to elucidate mechanisms involved at high concentrations of isoflavones paired with ZEN and its metabolites. As a final remark, this work strengthens previous investigations by excluding cytotoxic potential of the studied compounds at the physiological relevant concentrations. Co- occurrence of isoflavones, ZEN, and ZEN metabolites poses a pressing conundrum to be further investigated as similar modes of actions give rise to synergistic concerns. Monotone agricultural feed comprising largely of soy and corn portray ideal scenarios of enhanced toxicological properties, providing an example where consideration single-substance toxicity might be insufficient.

Keywords (deu)

IsoflavonePhytoöstrogeneZearalenonMycotoxineIshikawa Zellen

Keywords (eng)

IsoflavonesphytoestrogenszearalenonemycotoxinsIshikawa cells

Subject (deu)

Subject (deu)

Subject (deu)

Type (deu)