Title (eng)
Curing cancer in dogs
generation of caninized checkpoint inhibitors anti-PD-1 and anti-PD-L1 mAbs with specific canine constant IgG1 and IgG4 domains
Parallel title (deu)
Behandlung von Krebs bei Hunden
Produktion caninisierter monoklonaler anti-PD-1 und anti-PD-L1 Antikörper mit spezifischen caninen IgG1 und IgG4 Sequenzen
Author
Nicoletta Marquardt
Advisor
Erika Jensen-Jarolim
Assessor
Erika Jensen-Jarolim
Abstract (deu)
Hintergrund: Zu den am häufigsten angewandten Immuntherapien für die Behandlung von Krebs beim Menschen gehören monoklonale Antikörper (mAK), welche das Checkpoint Molekül „programmed cell death protein 1“ (PD 1) und deren Liganden, „programmed death-ligand 1“ (PD L1), hemmen. Vergleichbare Therapien sind für die Behandlung von Krebs bei Hunden (caniner Krebs; Canis familiaris) nicht verfügbar. Das Ziel dieses Projekts war deshalb die Entwicklung caninisierter anti PD 1 und anti PD L1 mAK, mit spezifischem caninen IgG1 oder IgG4. Methoden: Die Produktion von Plasmiden in Escherichia coli wurde optimiert, gefolgt von DNA-Aufreinigung und Sequenzierung. Eukaryotische Expi293F Zellen wurden transfektiert und mAK wurden mithilfe von Affinitätschromatographie aufgereinigt. SDS PAGE, Western blots und Dot blots wurden zur Detektion der caninisierten mAK angewandt. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Bindungsaffinitäten von humanen anti PD 1 und anti PD L1 mAK zu caninen Krebszelllinien, als auch zur Expressionszelllinie Expi293F, festzustellen. Ergebnisse: Mithilfe von Dot Blots wurden mAK aller Isotypen in der Zellkultur transfizierter Expi293F Zellen detektiert. Aufgereinigte caninisierte anti PD L1 IgG1 mAK wiesen auf SDS PAGE und Western Blots unter nicht reduzierenden Bedingungen eine Proteinbande mit einer Größe von 150 kDa auf, welche der Gesamtgröße des mAK entspricht, während unter reduzierenden Bedingungen zwei Proteinbanden mit Größen von 50 kDa und 25 kDa detektiert wurden, entsprechend den schweren und leichten Ketten der Antikörper. Ergebnisse der Durchflusszytometrie wiesen signifikante Bindungsaffinitäten der humanen anti PD 1 und anti PD L1 mAK zu den caninen Krebszelllinien auf, jedoch ebenso zur Expressionszelllinie Expi293F. Schlussfolgerung: Zusammenfassend bereiten die Resultate unserer Studie wichtige Grundlagen für die Entwicklung einer Immuntherapie gegen Krebs bei Hunden.
Abstract (eng)
Background: To date, the most successful human anti cancer immunotherapies include monoclonal antibodies (mAbs) against the checkpoint molecule programmed cell death protein 1 (PD 1) and its ligand programmed death-ligand 1 (PD L1), while the development of equivalent anti-cancer immunotherapies for dogs (canine cancer; Canis familiaris) lags far behind. To overcome this limitation, the goal of this project was the generation of caninized anti PD 1 and anti PD L1 mAbs with canine IgG1 or IgG4 constant regions. Methods: Plasmid production in Escherichia coli was optimized, followed by purification and DNA sequencing. Eukaryotic Expi293F cells were transfected and mAbs were purified via affinity chromatography. SDS PAGE, western blots and dot blots were used to detect caninized mAbs. Flow cytometric analyses were undertaken to determine the binding capacities of human anti PD 1 and anti PD L1 mAbs to canine cancer cell lines, as well as to the expression cell line Expi293F. Results: Via dot blots, mAbs of all isotypes were detected in the cell culture of transfected Expi293F cells. On SDS PAGE and western blots, purified caninized IgG1 anti PD L1 mAbs showed one band at a size of 150 kDa under non-reducing conditions corresponding to full-length antibodies and two bands with sizes of 50 kDa and 25 kDa, under reducing conditions, corresponding to heavy and light chains. Results from flow cytometric analyses showed significant binding of human anti PD 1 and anti PD L1 mAbs to all the canine cancer cell lines, however also to the expression cell line Expi293F. Conclusions: Overall, the results of our study provide an important foundation towards the establishment of an immunotherapy against dog cancer.
Keywords (deu)
Immuncheckpoint-InhibitorCaniner KrebsPD-1PD-L1
Keywords (eng)
Immune Checkpoint InhibitorCanine CancerPD-1PD-L1
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Extent (deu)
76 Seiten : Illustrationen
Number of pages
86
Study plan
Masterstudium Molekulare Biologie
[UA]
[066]
[834]
Association (deu)
Title (eng)
Curing cancer in dogs
generation of caninized checkpoint inhibitors anti-PD-1 and anti-PD-L1 mAbs with specific canine constant IgG1 and IgG4 domains
Parallel title (deu)
Behandlung von Krebs bei Hunden
Produktion caninisierter monoklonaler anti-PD-1 und anti-PD-L1 Antikörper mit spezifischen caninen IgG1 und IgG4 Sequenzen
Author
Nicoletta Marquardt
Abstract (deu)
Hintergrund: Zu den am häufigsten angewandten Immuntherapien für die Behandlung von Krebs beim Menschen gehören monoklonale Antikörper (mAK), welche das Checkpoint Molekül „programmed cell death protein 1“ (PD 1) und deren Liganden, „programmed death-ligand 1“ (PD L1), hemmen. Vergleichbare Therapien sind für die Behandlung von Krebs bei Hunden (caniner Krebs; Canis familiaris) nicht verfügbar. Das Ziel dieses Projekts war deshalb die Entwicklung caninisierter anti PD 1 und anti PD L1 mAK, mit spezifischem caninen IgG1 oder IgG4. Methoden: Die Produktion von Plasmiden in Escherichia coli wurde optimiert, gefolgt von DNA-Aufreinigung und Sequenzierung. Eukaryotische Expi293F Zellen wurden transfektiert und mAK wurden mithilfe von Affinitätschromatographie aufgereinigt. SDS PAGE, Western blots und Dot blots wurden zur Detektion der caninisierten mAK angewandt. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Bindungsaffinitäten von humanen anti PD 1 und anti PD L1 mAK zu caninen Krebszelllinien, als auch zur Expressionszelllinie Expi293F, festzustellen. Ergebnisse: Mithilfe von Dot Blots wurden mAK aller Isotypen in der Zellkultur transfizierter Expi293F Zellen detektiert. Aufgereinigte caninisierte anti PD L1 IgG1 mAK wiesen auf SDS PAGE und Western Blots unter nicht reduzierenden Bedingungen eine Proteinbande mit einer Größe von 150 kDa auf, welche der Gesamtgröße des mAK entspricht, während unter reduzierenden Bedingungen zwei Proteinbanden mit Größen von 50 kDa und 25 kDa detektiert wurden, entsprechend den schweren und leichten Ketten der Antikörper. Ergebnisse der Durchflusszytometrie wiesen signifikante Bindungsaffinitäten der humanen anti PD 1 und anti PD L1 mAK zu den caninen Krebszelllinien auf, jedoch ebenso zur Expressionszelllinie Expi293F. Schlussfolgerung: Zusammenfassend bereiten die Resultate unserer Studie wichtige Grundlagen für die Entwicklung einer Immuntherapie gegen Krebs bei Hunden.
Abstract (eng)
Background: To date, the most successful human anti cancer immunotherapies include monoclonal antibodies (mAbs) against the checkpoint molecule programmed cell death protein 1 (PD 1) and its ligand programmed death-ligand 1 (PD L1), while the development of equivalent anti-cancer immunotherapies for dogs (canine cancer; Canis familiaris) lags far behind. To overcome this limitation, the goal of this project was the generation of caninized anti PD 1 and anti PD L1 mAbs with canine IgG1 or IgG4 constant regions. Methods: Plasmid production in Escherichia coli was optimized, followed by purification and DNA sequencing. Eukaryotic Expi293F cells were transfected and mAbs were purified via affinity chromatography. SDS PAGE, western blots and dot blots were used to detect caninized mAbs. Flow cytometric analyses were undertaken to determine the binding capacities of human anti PD 1 and anti PD L1 mAbs to canine cancer cell lines, as well as to the expression cell line Expi293F. Results: Via dot blots, mAbs of all isotypes were detected in the cell culture of transfected Expi293F cells. On SDS PAGE and western blots, purified caninized IgG1 anti PD L1 mAbs showed one band at a size of 150 kDa under non-reducing conditions corresponding to full-length antibodies and two bands with sizes of 50 kDa and 25 kDa, under reducing conditions, corresponding to heavy and light chains. Results from flow cytometric analyses showed significant binding of human anti PD 1 and anti PD L1 mAbs to all the canine cancer cell lines, however also to the expression cell line Expi293F. Conclusions: Overall, the results of our study provide an important foundation towards the establishment of an immunotherapy against dog cancer.
Keywords (deu)
Immuncheckpoint-InhibitorCaniner KrebsPD-1PD-L1
Keywords (eng)
Immune Checkpoint InhibitorCanine CancerPD-1PD-L1
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Number of pages
86
Association (deu)
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