Title (eng)
Imitated synthetic E. Coli ribosomal complex and XL-MS optimisation
Parallel title (deu)
Imitierter synthetischer E. Coli ribosomaler Komplex und XLMS-Optimierung
Author
Adrian-Daniel Vasiu
Advisor
Christopher Gerner
Assessor
Christopher Gerner
Abstract (deu)
Crosslinking-Massenspektrometrie ist ein integrativer Teil der Proteomik-Forschung und ist in der Lage, Einblicke sowohl in die Protein-Netzwerke als auch in die Kontaktoberflächen zwischen Proteinen sowie in die dreidimensionale Struktur eines Proteinkomplexes und dessen Dynamik zu geben. Diese Masterarbeit beginnt mit einer ausführlichen Einführung in die Massenspektrometrie im Bereich der Proteomik, gekoppelt mit chemischem Crosslinking. Es wird die Entwicklungsgeschichte der massenspektrometrischen Geräte, deren Arten und Instrumentalisierung erklärt. Darüber hinaus werden verschiedene Crosslinker-Reagenzien präsentiert, deren Chemie und die technischen Aspekte, die man betrachten muss, wenn ein Crosslinking-Massenspektrometrie-Workflow durchgeführt wird. Die state-of-the-art Methode von Beveridge et al. Wurde übernommen und weiterentwickelt. Dabei wurden nicht nur Verbesserungen im chemischen Design der Peptide erzielt, sondern auch das Peptid-Bibliotheks-Portfolio erweitert. Es wurden drei neue Peptid-Bibliotheken erstellt, mit deren Hilfe die Linker DSSO, DSBU, CDI, DSBSO, ADH und DHSO getestet wurden und die Reaktionsbedingungen verfeinert wurden, um die Anzahl der Vernetzungen zwischen den kovalent gebundenen synthetischen Peptiden zu maximieren. Der wahrscheinlich wichtigste Punkt war jedoch eine Neuberechnung der False-Discovery-Rate-Werte und deren Minimierung. Verschiedene Anreicherungsstrategien wurden ebenfalls evaluiert, die zu vielversprechenden Ergebnissen führten. Selbst bei einer Impurifizierung der ursprünglichen Probe mit HEK-Peptiden im Verhältnis 1:100 konnten mehrere Links gefunden werden, wenn die richtige Anreicherungsmethode ausgewählt wurde, als in der reinen, nicht impurifizierten Probe. Schließlich wurde auch ein neues, vielversprechendes XL-MS-Verfahren entwickelt, das auf dem Hinzufügen von Fettsäuren zur Probe vor dem Linking-Reagenz basiert, um die Anzahl der unspezifischen Links zu reduzieren und die Anzahl der erreichten Links weiter zu steigern. Das neue Protokoll wurde bereits an BSA- und GroEL-Proteinen getestet.
Abstract (eng)
Crosslinking mass spectrometry is an integrative part of proteomics research and is capable of providing insights into both protein networks and contact surfaces between proteins, as well as the three-dimensional structure of a protein complex and its dynamics. This master’s thesis begins with a detailed introduction to mass spectrometry in the field of proteomics, coupled with chemical crosslinking. The development history of mass spectrometric devices, their types and instrumentation is also explained. In addition, various crosslinker reagents are presented, their chemistry, and the technical aspects to consider when performing a crosslinking mass spectrometry workflow. The state-of-the-art method of Beveridge et al. of assessing and optimizing crosslink workflows through a large and versatile synthetic peptide library was adopted and further developed. Not only were improvements made in the chemical design of the peptides, but the peptide library portfolio was also expanded. Three new peptide libraries were created, which were used to test the linkers DSSO, DSBU, CDI, DSBSO, ADH, and DHSO, and to refine the reaction conditions to maximize the number of cross-links between the covalently bound synthetic peptides. Probably the most important point, however, was a recalculation of the false discovery rate values and their minimization. Various enrichment strategies were also evaluated with promising results. Even when the original sample was spiked with HEK peptides at a ratio of 1:100, more links could be found when the correct enrichment method was selected, compared to the purified peptide mix without any background proteome added. Finally, a new highly promising XL-MS protocol based on adding fatty acids to the sample prior to the linking reaction was also developed to reduce the number of non-specific links and to further increase the total number of links obtained. The new protocol has already been tested on BSA and GroEL proteins.
Keywords (deu)
MassenspektrometrieCrosslinking OptimierungGroEL Crosslinking
Keywords (eng)
Mass spectrometrycrosslinking optimizationGroEL crosslinking
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1656467
rdau:P60550 (deu)
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Number of pages
71
Association (deu)
Title (eng)
Imitated synthetic E. Coli ribosomal complex and XL-MS optimisation
Parallel title (deu)
Imitierter synthetischer E. Coli ribosomaler Komplex und XLMS-Optimierung
Author
Adrian-Daniel Vasiu
Abstract (deu)
Crosslinking-Massenspektrometrie ist ein integrativer Teil der Proteomik-Forschung und ist in der Lage, Einblicke sowohl in die Protein-Netzwerke als auch in die Kontaktoberflächen zwischen Proteinen sowie in die dreidimensionale Struktur eines Proteinkomplexes und dessen Dynamik zu geben. Diese Masterarbeit beginnt mit einer ausführlichen Einführung in die Massenspektrometrie im Bereich der Proteomik, gekoppelt mit chemischem Crosslinking. Es wird die Entwicklungsgeschichte der massenspektrometrischen Geräte, deren Arten und Instrumentalisierung erklärt. Darüber hinaus werden verschiedene Crosslinker-Reagenzien präsentiert, deren Chemie und die technischen Aspekte, die man betrachten muss, wenn ein Crosslinking-Massenspektrometrie-Workflow durchgeführt wird. Die state-of-the-art Methode von Beveridge et al. Wurde übernommen und weiterentwickelt. Dabei wurden nicht nur Verbesserungen im chemischen Design der Peptide erzielt, sondern auch das Peptid-Bibliotheks-Portfolio erweitert. Es wurden drei neue Peptid-Bibliotheken erstellt, mit deren Hilfe die Linker DSSO, DSBU, CDI, DSBSO, ADH und DHSO getestet wurden und die Reaktionsbedingungen verfeinert wurden, um die Anzahl der Vernetzungen zwischen den kovalent gebundenen synthetischen Peptiden zu maximieren. Der wahrscheinlich wichtigste Punkt war jedoch eine Neuberechnung der False-Discovery-Rate-Werte und deren Minimierung. Verschiedene Anreicherungsstrategien wurden ebenfalls evaluiert, die zu vielversprechenden Ergebnissen führten. Selbst bei einer Impurifizierung der ursprünglichen Probe mit HEK-Peptiden im Verhältnis 1:100 konnten mehrere Links gefunden werden, wenn die richtige Anreicherungsmethode ausgewählt wurde, als in der reinen, nicht impurifizierten Probe. Schließlich wurde auch ein neues, vielversprechendes XL-MS-Verfahren entwickelt, das auf dem Hinzufügen von Fettsäuren zur Probe vor dem Linking-Reagenz basiert, um die Anzahl der unspezifischen Links zu reduzieren und die Anzahl der erreichten Links weiter zu steigern. Das neue Protokoll wurde bereits an BSA- und GroEL-Proteinen getestet.
Abstract (eng)
Crosslinking mass spectrometry is an integrative part of proteomics research and is capable of providing insights into both protein networks and contact surfaces between proteins, as well as the three-dimensional structure of a protein complex and its dynamics. This master’s thesis begins with a detailed introduction to mass spectrometry in the field of proteomics, coupled with chemical crosslinking. The development history of mass spectrometric devices, their types and instrumentation is also explained. In addition, various crosslinker reagents are presented, their chemistry, and the technical aspects to consider when performing a crosslinking mass spectrometry workflow. The state-of-the-art method of Beveridge et al. of assessing and optimizing crosslink workflows through a large and versatile synthetic peptide library was adopted and further developed. Not only were improvements made in the chemical design of the peptides, but the peptide library portfolio was also expanded. Three new peptide libraries were created, which were used to test the linkers DSSO, DSBU, CDI, DSBSO, ADH, and DHSO, and to refine the reaction conditions to maximize the number of cross-links between the covalently bound synthetic peptides. Probably the most important point, however, was a recalculation of the false discovery rate values and their minimization. Various enrichment strategies were also evaluated with promising results. Even when the original sample was spiked with HEK peptides at a ratio of 1:100, more links could be found when the correct enrichment method was selected, compared to the purified peptide mix without any background proteome added. Finally, a new highly promising XL-MS protocol based on adding fatty acids to the sample prior to the linking reaction was also developed to reduce the number of non-specific links and to further increase the total number of links obtained. The new protocol has already been tested on BSA and GroEL proteins.
Keywords (deu)
MassenspektrometrieCrosslinking OptimierungGroEL Crosslinking
Keywords (eng)
Mass spectrometrycrosslinking optimizationGroEL crosslinking
Subject (deu)
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Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1661593
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71
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