Soja ist schon lange eine Hauptquelle für Protein in Tierfutter, auch durch seine ernährungsphysiologischen Eigenschaften. Es wurde mit verschiedenen Vorteilen in Verbindung gebracht, darunter Wachstumsförderung, gestärkte antioxidative Kapazitäten und verbesserte Immunfunktionen aufgrund des Vorhandenseins von Isoflavonen (ISF). Allerdings ist dieser Bereich nicht frei von Komplexitäten. Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass eine erhöhte Aufnahme von ISF, obwohl in vielerlei Hinsicht vorteilhaft, nachteilige Folgen haben kann, insbesondere im Hinblick auf die reproduktive Gesundheit weiblicher Nutztiere, was potenziell zu Problemen wie Unfruchtbarkeit, Gebärmuttervorfall und Drüsenanomalien führen kann. Besonders interessant ist die häufige gemeinsame Anwesenheit von Isoflavonen und dem Mykotoxin Zearalenon (ZEN) in Tierfuttermitteln. ZEN, das von bestimmten Fusarium-Arten erzeugt wird, ist ein sekundärer Pilzmetabolit, der in Getreide und Hülsenfrüchten häufig nachgewiesen wird. ZEN ist berüchtigt für seine vielfältigen toxischen Wirkungen sowohl auf Menschen als auch auf Tiere, wobei ein zentraler Aspekt seine starke endokrine Störungsfähigkeit ist. Sein Metabolit α-Zearalenol (α-ZEL) zeigt noch stärkere östrogene Effekte, während bestimmte Phase-II-Metaboliten wie ZEN-14-Glucosid einen Verlust östrogenartiger Eigenschaften aufweisen. Sowohl ISF als auch ZEN weisen strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit dem natürlichen Hormon 17-β-Östradiol (E2) auf, was sie zu Xenoöstrogenen macht, die Östrogenrezeptoren (ER) aktivieren, obwohl ihre Affinitäten zu den verschiedenen ER-Isoformen α und β variieren. Bemerkenswert ist, dass ZEN eine größere Affinität zu ERα aufweist, während ISF eine erhöhte Affinität zu ERβ zeigen. Diese Unterscheidung deutet auf die Möglichkeit verstärkter östrogenartiger Effekte hin, wenn diese beiden Gruppen von Verbindungen gemeinsam auftreten. Angesichts dieser Aspekte wurden regulatorische Schwellenwerte für ZEN in Lebensmitteln und Futtermitteln festgelegt, um seine potenziell nachteiligen gesundheitlichen Auswirkungen zu berücksichtigen. Allerdings konzentrieren sich aktuelle Risikobewertungen hauptsächlich auf die individuellen toxikologischen Profile einzelner Verbindungen, wodurch die kumulative Toxizität von Mischungen möglicherweise unterschätzt wird. Daher ist eine umfassende Bewertung von Verbindungsinteraktionen erforderlich, um robustere Sicherheitsbewertungen zu ermöglichen. Unsere Studien zielten darauf ab, eine eingehende Erkundung der Wechselwirkungen zwischen Mykotoxinen und Phytoöstrogenen durchzuführen. In dieser Dissertation wurden die Auswirkungen verschiedener Substanzen auf die östrogene Aktivität untersucht, wobei der Schwerpunkt insbesondere auf Mykotoxinen und Phytoöstrogenen lag. Die Forschung ergab, dass α-ZEL die stärkste Östrogenwirkung hat, gefolgt von α-ZAL und ZEN, in der Ishikawa-Zelllinie. Auf der anderen Seite zeigte ZEN-14-S aufgrund seiner konjugierten Form kein östrogenes Potenzial, wie es in Experimenten und früheren Berechnungen beobachtet wurde. Während ZEN bei sehr hohen Konzentrationen zytotoxische Effekte auslösen kann, führten die für die Studien in den Ishikawa-Zellen verwendeten Konzentrationen (im Bereich von 0,001 bis 10 nM) nicht zu signifikanter Zytotoxizität. Interessanterweise lösten einige Konzentrationen von ZEN und seinen Metaboliten tatsächlich eine Zunahme der zellulären Aktivität aus, was auf mitochondriale Schwellungen oder andere Mechanismen zurückzuführen sein könnte. Dies legt nahe, dass diese Mykotoxine proliferative Effekte haben könnten. Phytoöstrogene, die in sojabasierten Produkten vorkommen, wurden in verschiedenen Konzentrationen getestet, um ihre östrogene Potenz zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigten, dass GEN, DAI und EQ die Expression von ALP (einem Marker für östrogene Aktivität) in abhängiger Konzentration erhöhten. GLY hatte jedoch selbst bei höheren Konzentrationen nur einen begrenzten Einfluss auf die ALP-Expression. Im Vergleich zu ZEN und seinen Derivaten waren wesentlich höhere Konzentrationen von Phytoöstrogenen erforderlich, um ähnliche östrogene Effekte zu erzielen. Weitere Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Mykotoxinen und Phytoöstrogenen ergaben, dass Kombinationen dieser Substanzen häufig zu einer stärkeren Induktion von ALP führten als einzelne Verbindungen. Die durchgeführten Experimente deuteten auch auf synergistische östrogene Effekte zwischen bestimmten Mykotoxinen und Phytoöstrogenen hin, insbesondere bei niedrigeren Konzentrationen. Mit steigenden ISF-Konzentrationen neigten die Wechselwirkungen jedoch dazu, additiv oder sogar antagonistisch zu werden. Die Kombination von ZEN und EQ zeigte den stärksten östrogenen Effekt. Es wird vermutet, dass die Wechselwirkungen zwischen Phytoöstrogenen und Mykotoxinen von ihren Interaktionen mit Östrogenrezeptoren (ER), insbesondere ERα und ERβ, beeinflusst wurden. Während ZEN und seine Metaboliten eine stärkere Affinität zu beiden ER aufwiesen, interagierten Phytoöstrogene hauptsächlich mit ERβ. Dieses Interaktionsmuster trug wahrscheinlich zu den beobachteten synergistischen Effekten bei. Zusammenfassend betonte die Studie die komplexen Wechselwirkungen zwischen Mykotoxinen und Phytoöstrogenen und deutete darauf hin, dass ihre kombinierten Effekte bei der Risikobewertung berücksichtigt werden müssen. Das Potenzial für verstärkte östrogene Effekte, insbesondere in Anwesenheit bestimmter Kombinationen, legt die Notwendigkeit einer Neubewertung von Sicherheitsgrenzen nahe und erfordert ein Verständnis der Implikationen, besonders für Nutztierfutter und menschlichen Konsum. Weiterführende Forschung und In-vivo-Studien sind unerlässlich, um diese Ergebnisse und ihre breiteren Auswirkungen auf die Verbrauchersicherheit zu bestätigen. In den in Ishikawa durchgeführten Experimenten konnte gezeigt werden, dass Kombinationen bestimmter ISF mit ZEN und seinen Metaboliten synergistische östrogene Effekte haben, insbesondere in Zelllinien, die beide ER-Isoformen (ERα und ERβ) exprimieren. Es wird vermutet, dass diese verstärkten Effekte aufgrund der Anwesenheit beider ER-Isoformen entstehen. Während ZEN und seine Metaboliten an beide ER-Isoformen binden können, interagieren ISF hauptsächlich mit ERβ. Wenn wir jedoch diese Kombinationen in Zelllinien testeten, die nur ERα gemäß den OECD-Richtlinien exprimierten, beobachteten wir keine verstärkten östrogenen Effekte aufgrund des Fehlens von ERβ. Mit Hilfe eines Luciferase-Reporter-Assays konnte gezeigt werden, dass α-ZEL eine höhere Potenz zur Induktion von Luciferase hatte als ZEN in Konzentrationen zwischen 0,01 und 10 nM. Es ist bekannt, dass Phase-I-Metaboliten wie α-ZEL oft stärkere östrogene Effekte als ihre Ausgangsverbindungen aufweisen. Bei einer Konzentration von 100 nM hatten beide Mykoöstrogene ähnliche Effekte auf die Luciferase-Induktion. Interessanterweise war zu beobachten bei Vergleichen der östrogenen Effekte dieser Verbindungen zwischen verschiedenen Zelllinien, dass höhere Konzentrationen in Zellen benötigt wurden, die nur ERα exprimierten, um dieselben Effekte zu erzielen wie in Zellen, die beide ER-Isoformen exprimierten. Kombinationen von Mykoöstrogenen und ISF zeigten im Vergleich zu Einzelsubstanzen keine erhöhte Luciferase-Aktivität. ISF induzierten jedoch Luciferase-Aktivitäten, die bis zu dreimal höher waren als die des positiven Kontrollwertes (E2). Dies war jedoch nicht durch Rezeptoraktivierung vermittelt. Um zu bestätigen, ob die erhöhte Luciferase-Aktivität tatsächlich eine erhöhte transkriptionale Aktivität widerspiegelte, maßen wir die mRNA-Expression des Luciferase-Gens in Zellen, die nur ERα exprimierten. ISF erhöhten die transkriptionale Aktivität nur geringfügig und konnten den durch E2 induzierten Effekt nicht übertreffen. Dies deutet darauf hin, dass die beobachtete Superinduktion durch ISF in diesen Zellen nicht direkt durch ERα vermittelt wird. Es wurde untersucht, ob ISF mit Luciferase interagieren und das Enzym stabilisieren und den Abbau beeinflussen. Tatsächlich beobachteten wir, dass die Stabilität des Enzyms erhöht wurde, wenn wir Zellen mit ZEN inkubierten und dann ISF hinzufügten, was im Laufe der Zeit zu einer höheren Aktivität führte. Dies unterstützte unsere Hypothese, dass ISF Luciferase stabilisieren können und erklärte die hohen Biolumineszenzsignale, die in Kombinationsversuchen beobachtet wurden. Zusammenfassend betonten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die Notwendigkeit beider ER-Isoformen für synergistische östrogene Effekte und legten nahe, dass die OECD-Richtlinie 455 möglicherweise nicht für Tests von Wechselwirkungen mit ISF bei Konzentrationen über 1 µM geeignet ist. Es wurde die Bedeutung des Verständnisses der Einschränkungen des Testsystems bei der Anwendung des Luciferase-Assays hervor und lieferten Einblicke in die Wechselwirkung zwischen ISF und dem Luciferase-Enzym.

Soy has long been a mainstay as a protein source in animal feed, driven by its nutritional attributes. It has been associated with various benefits, including growth promotion, bolstered antioxidative capacities, and enhanced immune functions due to the presence of isoflavones (ISF). However, this landscape is not devoid of complexities. Research suggests that elevated ISF intake, while beneficial in many aspects, can have detrimental consequences, particularly concerning the reproductive health of female farm animals, potentially leading to issues such as infertility, uterine prolapse, and glandular abnormalities. Of intriguing note is the frequent co-presence of isoflavones and the mycotoxin zearalenone (ZEN) in animal feeds. ZEN, generated by certain Fusarium species, is a secondary fungal metabolite commonly detected in grains and legumes. ZEN is notorious for its varied toxic effects on both humans and animals, with a central facet being its potent endocrine-disrupting prowess. Its metabolite α-zearalenol (α-ZEL) demonstrates even stronger estrogenic effects, while certain phase II metabolites, like ZEN-14-glucoside, exhibit a loss of estrogenic properties. Both ISF and ZEN share structural and functional similarities with the natural hormone 17-β-estradiol (E2), rendering them xenoestrogens that activate estrogen receptors (ER), although their affinities toward different ER isoforms α and β vary. Notably, ZEN has a greater affinity for ERα, whereas ISF exhibit heightened affinity for ERβ. This distinction hints at the possibility of augmented estrogenic effects when these two groups of compounds coexist. Considering these aspects, regulatory thresholds for ZEN in food and feed have been established, accounting for its potential adverse health effects. However, current risk assessments primarily focus on the individual toxicological profiles of single compounds, potentially underestimating the cumulative toxicity of mixtures. Consequently, a comprehensive evaluation of compound interactions is needed for more robust safety evaluations. In this thesis the effects of various substances on estrogenic activity, particularly focusing on mycotoxins and phytoestrogens were studied. The research revealed that alpha-zearalenol (α-ZEL) is the most potent estrogen, followed by alpha-zearalanol (α-ZAL) and ZEN, in the Ishikawa cell line. On the other hand, ZEN-14-sulfate (ZEN-14-S) showed no estrogenic potential due to its conjugated form, as observed through experiments and previous computational studies. While ZEN can induce cytotoxic effects at very high concentrations, the concentrations used for the studies in the Ishikawa cells (ranging from 0.001 to 10 nM) did not lead to significant cytotoxicity. Interestingly, some concentrations of ZEN and its metabolites actually triggered an increase in cellular activity, which might be due to mitochondrial swelling or other mechanisms. This suggests that these mycotoxins could have proliferative effects. Phytoestrogens, found in soy-based products, were tested at various concentrations to assess their estrogenic potency. The results showed that genistein (GEN), daidzein (DAI), and equol (EQ) increased the expression of ALP (a marker of estrogenic activity) in a concentration-dependent manner. However, GLY only had a limited impact on ALP expression, even at higher concentrations. In comparison to ZEN and its derivatives, much higher concentrations of phytoestrogens were needed to achieve similar estrogenic effects. Further investigations into the interactions between mycotoxins and phytoestrogens revealed that combinations of these substances often resulted in higher ALP induction compared to individual compounds. The conducted experiments also suggested synergistic estrogenic effects between certain mycotoxins and phytoestrogens, particularly at lower concentrations. However, as ISF concentrations increased, the interactions tended to become additive or even antagonistic. The combination of ZEN and EQ exhibited the most potent estrogenic effect. It is hypothesized that the interactions between phytoestrogens and mycotoxins were influenced by their interactions with estrogen receptors (ERs), specifically ERα and ERβ. While ZEN and its metabolites had stronger affinities for both ERs, phytoestrogens primarily interacted with ERβ. This interaction pattern likely contributed to the observed synergistic effects. In conclusion, the study highlighted the complex interactions between mycotoxins and phytoestrogens, indicating that their combined effects need to be considered for risk assessment. The potential for enhanced estrogenic effects, especially in the presence of certain combinations, suggests a need for reevaluating safety limits and understanding the implications, particularly for livestock feed and human consumption. Further research and in vivo studies are essential to confirm these findings and their broader implications for consumer safety. In the experiments conducted in Ishikawa, we demonstrated that combinations of certain ISF with ZEN and its metabolites have synergistic estrogenic effects, particularly in cell lines expressing both ER isoforms (ERα and ERβ). We proposed that these enhanced effects arise from the presence of both ER isoforms. Tested these combinations in cell lines expressing only ERα, as per OECD guidelines, we did not observe enhanced estrogenic effects due to the lack of ERβ. Using a luciferase reporter assay, we found that α-ZEL had a higher potency to induce luciferase than ZEN at concentrations between 0.01 and 10 nM. It is known that phase I metabolites like α-ZEL often have stronger estrogenic effects than their parent compounds. At a concentration of 100 nM, both mycoestrogens had similar effects on luciferase induction. Interestingly, when comparing these compounds' estrogenic effects between different cell lines, we noted that higher concentrations were needed in cells expressing only ERα to achieve the same effects as in cells expressing both ER isoforms. Combinations of mycoestrogens and ISF did not show increased luciferase activity compared to single substances. However, ISF induced luciferase activities up to three times higher than the positive control (E2), but this was not mediated by receptor activation. To confirm if increased firefly luciferase activity truly reflected increased transcriptional activity, we measured mRNA expression of the luciferase gene in cells expressing only ERα. ISF only slightly increased transcriptional activity and could not surpass the effect induced by E2, indicating the observed superinduction by ISF in these cells is not directly mediated by ERα. We explored whether ISF interact with luciferase, stabilizing the enzyme and affecting its degradation. Indeed, when we incubated cells with ZEN and then added ISF, we observed increased stability of the enzyme, leading to higher activity over time. This supported our hypothesis that ISF can stabilize luciferase, explaining the high bioluminescence signals observed in combination experiments. In summary, our findings emphasized the need for both ER isoforms for synergistic estrogenic effects and suggested that OECD guideline 455 might not be applicable for testing interactions involving ISF at concentrations above 1 µM. We highlighted the importance of understanding the test system's limitations when applying the luciferase assay and provided insights into the interaction between ISF and the luciferase enzyme.