Title (eng)
Establishment of a Th17/Calu-3 co-culture model for the evaluation of neutrophil migration
Parallel title (deu)
Etablierung eines Th-17/Calu-3 Co-Kulturmodells zur Beurteilung der Migration von Neutrophilen
Author
Rafael Opferkuch
Advisor
Verena Dirsch
Co-Advisor
Alexander Franz Perhal
Assessor
Verena Dirsch
Abstract (deu)
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Etablierung einer in vitro Methodik zur Quantifizierung der Aktivität mutmaßlicher RORyt inversen Agonisten anhand der Beurteilung der Anzahl der durch eine Zellschicht gewanderten neutrophilen Granulozyten. Der Versuchsaufbau bestand aus einem invertierten Gewebekultur-Insert-Aufbau, mit einer Zellschicht aus Calu-3 Lungenepithelzellen und aus menschlichem Blut isolierte neutrophile Granulozyten. Als chemotaktischer Stimulus wurden Überstände von Th17-Zellen verwendet. Diese Überstände wurden von naiven T-Zellen gewonnen, die zu Th17-Zellen differenziert wurden, während sie mit (vermutlichen) inversen RORyt Agonisten behandelt wurden. Erste Tests des Versuchsaufbaus mit bekannten chemotaktischen Substanzen und Substanzen, die deren Produktion in Calu-3-Zellen induzieren, waren vielversprechend. Diese ersten Tests bestätigten den erwarteten Trend einer vermehrten Migration der neutrophilen Granulozyten mit steigender IL-17 Konzentration in Kombination mit einer konstanten TNFa Konzentration im Medium. Das Hauptexperiment jedoch, in dem die T-Zell Überstäande verwendet wurden, lieferte inkonsistente Ergebnisse. Ein Durchflusszytometer wurde zur Validierung und Analyse der Neutrophilen an entscheidenden Stellen während des Assays eingesetzt. Leider konnte nur eine erfolgreiche Isolierung der Neutrophilen damit verifiziert werden. Versuche, die Neutrophilenmigration an anderen Stellen zu validieren, waren auf- grund dieser Geräteausfälle nicht erfolgreich. Deshalb wurde ein Python-Skript zur Zellzählung geschrieben. Dieses Skript lieferte einen vorläufigen, aber dennoch aufschlussreichen Einblick, der zu neuen Ideen für zukünftige Verbesserung und zum Erkenntnisgewinn für das Versagen des Assays führten. Sollten die zu Grunde liegenden Ursachen für das Fehlschlagen gefunden und die Methodik kann mit einem funktionierenden Durchflusszytometer validiert werden, könnten zuverlässige und reproduzierbare Daten produziert werden. Dieses Assay kann dann als Screeningmethode mit einer höheren physiologischen Relevanz verwendet werden und neue Einblicke in die Neutrophilenmigration gewonnen werden.
Abstract (eng)
The primary aim of this thesis was to establish an in vitro migration assay for quantifying the effects of suspected inverse RORγt agonists by assessing the amount of migrated neutrophil granulocytes through a cell layer. The assay employed neutrophils, isolated from human blood, migrating through a layer of Calu-3 lung epithelial cells, in an inverse tissue culture insert setup. As the chemotactic stimulus, supernatants of TH17 cells, obtained by isolating na ̈ıve T-cells and differentiating them into TH17 cells, were used. During this differentiation process, the T-cells were treated with (suspected) RORγt inverse agonists. Initial tests for the first validation of the assay with known chemotactic substances and substances that induce their production in Calu-3 cells were promising. These tests confirmed the expected trend of elevated neutrophil migration with increasing IL-17 concentrations in combination with a constant TNFα concentration. However, the main experiment, in which supernatants were used, yielded inconsistent results. A flow cytometer was used for validating and analyzing important steps in the assay. Unfortunately, only one successful neutrophil isolation could be verified. Attempts to validate other steps in the migration assay were unsuccessful due to this equipment issue. Therefore a Python script for cell counting was written. It provided preliminary insights, leading to new ideas for improvements and reasons for the assay not working as expected, If the underlying causes for failure are figured out and the methodologies can be validated using a working flow cytometer, it could potentially produce reliable and reproducible data. The assay could then be used as a screening method that possesses a greater physiological relevance and help to understand neutrophil migration better.
Keywords (deu)
Calu-3 ZellinieTh17-ZellenNeutrophile Granuluzyten MigrationCo-KulturRORγt
Keywords (eng)
neutrophil migration assayCo-CultureTh17 cellsCalu-3 cell line
Subject (deu)
Pharmazeutische Biologie
Type (deu)
Masterarbeit
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:2067089
DOI
10.25365/thesis.76026
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11161.74279.479397-7
URI
https://utheses.univie.ac.at/detail/71363
Extent (deu)
xiv, 97 Seiten : Illustrationen
Number of pages
112
Study plan
Masterstudium Pharmazie
[UA]
[066]
[605]
Association (deu)
Fakultät für Lebenswissenschaften
Members (1)
Title (eng)
Establishment of a Th17/Calu-3 co-culture model for the evaluation of neutrophil migration
Parallel title (deu)
Etablierung eines Th-17/Calu-3 Co-Kulturmodells zur Beurteilung der Migration von Neutrophilen
Author
Rafael Opferkuch
Abstract (deu)
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Etablierung einer in vitro Methodik zur Quantifizierung der Aktivität mutmaßlicher RORyt inversen Agonisten anhand der Beurteilung der Anzahl der durch eine Zellschicht gewanderten neutrophilen Granulozyten. Der Versuchsaufbau bestand aus einem invertierten Gewebekultur-Insert-Aufbau, mit einer Zellschicht aus Calu-3 Lungenepithelzellen und aus menschlichem Blut isolierte neutrophile Granulozyten. Als chemotaktischer Stimulus wurden Überstände von Th17-Zellen verwendet. Diese Überstände wurden von naiven T-Zellen gewonnen, die zu Th17-Zellen differenziert wurden, während sie mit (vermutlichen) inversen RORyt Agonisten behandelt wurden. Erste Tests des Versuchsaufbaus mit bekannten chemotaktischen Substanzen und Substanzen, die deren Produktion in Calu-3-Zellen induzieren, waren vielversprechend. Diese ersten Tests bestätigten den erwarteten Trend einer vermehrten Migration der neutrophilen Granulozyten mit steigender IL-17 Konzentration in Kombination mit einer konstanten TNFa Konzentration im Medium. Das Hauptexperiment jedoch, in dem die T-Zell Überstäande verwendet wurden, lieferte inkonsistente Ergebnisse. Ein Durchflusszytometer wurde zur Validierung und Analyse der Neutrophilen an entscheidenden Stellen während des Assays eingesetzt. Leider konnte nur eine erfolgreiche Isolierung der Neutrophilen damit verifiziert werden. Versuche, die Neutrophilenmigration an anderen Stellen zu validieren, waren auf- grund dieser Geräteausfälle nicht erfolgreich. Deshalb wurde ein Python-Skript zur Zellzählung geschrieben. Dieses Skript lieferte einen vorläufigen, aber dennoch aufschlussreichen Einblick, der zu neuen Ideen für zukünftige Verbesserung und zum Erkenntnisgewinn für das Versagen des Assays führten. Sollten die zu Grunde liegenden Ursachen für das Fehlschlagen gefunden und die Methodik kann mit einem funktionierenden Durchflusszytometer validiert werden, könnten zuverlässige und reproduzierbare Daten produziert werden. Dieses Assay kann dann als Screeningmethode mit einer höheren physiologischen Relevanz verwendet werden und neue Einblicke in die Neutrophilenmigration gewonnen werden.
Abstract (eng)
The primary aim of this thesis was to establish an in vitro migration assay for quantifying the effects of suspected inverse RORγt agonists by assessing the amount of migrated neutrophil granulocytes through a cell layer. The assay employed neutrophils, isolated from human blood, migrating through a layer of Calu-3 lung epithelial cells, in an inverse tissue culture insert setup. As the chemotactic stimulus, supernatants of TH17 cells, obtained by isolating na ̈ıve T-cells and differentiating them into TH17 cells, were used. During this differentiation process, the T-cells were treated with (suspected) RORγt inverse agonists. Initial tests for the first validation of the assay with known chemotactic substances and substances that induce their production in Calu-3 cells were promising. These tests confirmed the expected trend of elevated neutrophil migration with increasing IL-17 concentrations in combination with a constant TNFα concentration. However, the main experiment, in which supernatants were used, yielded inconsistent results. A flow cytometer was used for validating and analyzing important steps in the assay. Unfortunately, only one successful neutrophil isolation could be verified. Attempts to validate other steps in the migration assay were unsuccessful due to this equipment issue. Therefore a Python script for cell counting was written. It provided preliminary insights, leading to new ideas for improvements and reasons for the assay not working as expected, If the underlying causes for failure are figured out and the methodologies can be validated using a working flow cytometer, it could potentially produce reliable and reproducible data. The assay could then be used as a screening method that possesses a greater physiological relevance and help to understand neutrophil migration better.
Keywords (deu)
Calu-3 ZellinieTh17-ZellenNeutrophile Granuluzyten MigrationCo-KulturRORγt
Keywords (eng)
neutrophil migration assayCo-CultureTh17 cellsCalu-3 cell line
Subject (deu)
Pharmazeutische Biologie
Type (deu)
Masterarbeit
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:2071301
Number of pages
112
Association (deu)
Fakultät für Lebenswissenschaften
License
All rights reserved
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