Title (eng)
Investigating the predictive power of in vitro drug testing in multicellular spheroids for in vivo activity
Author
Ramona Velasco-Pelaez
Advisor
Bernhard Keppler
Co-Advisor
Michael Jakupec
Assessor
Bernhard Keppler
Abstract (deu)
Bei der Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von Krebs gibt es eine Diskrepanz zwischen der Anzahl an Substanzen, welche vielversprechende Ergebnisse in vitro zeigen, und jenen, welche auch im Tiermodell Wirksamkeit aufweisen. Um die Anzahl der Tierversuche zu reduzieren und eine höhere Treffsicherheit in der Vorauswahl von Substanzen zu erreichen, wurden die In-vitro-Testbedingungen optimiert. Entwicklungen der letzten Jahre ermöglichen die Verwendung von multizellulären Tumor-Sphäroiden (3D Zellkultur) im Hochdurchsatz-Screening. Diese weisen gewisse Charakteristika von Tumoren auf (Hypoxie, Nekrose) und ähneln stärker dem ursprünglichen Tumorgewebe hinsichtlich Morphologie und Genexpression. Daher wird ihnen eine höhere Prädiktivität für In-vivo-Aktivität zugeschrieben, wofür jedoch kaum Evidenz vorliegt. Von den zahlreichen am Institut für Anorganische Chemie der Universität Wien synthetisierten Verbindungen wurden bereits mehr als 30 an einem Kolonkarzinommodell (CT26) in vivo getestet. Dabei handelt es sich um Pt(II)-, Pt(IV)-, La(III)-, Ru(II)-, Ru(III)-, Ga(III)-, Os(II)-, Rh(III)- und Mo(IV)-Verbindungen, sowie Thiosemicarbazone. Die daraus gewonnenen Daten dienen nun als Grundlage, die Vorhersagekraft verschiedener In-vitro-Testmethoden zu untersuchen. Hierzu wurden im Laufe dieser Masterarbeit 29 Substanzen parallel in zwei Darmkrebs-Zelllinien, CT26 (murin) sowie HCT116 (human), in 2D Zellkulturen sowie an multizellulären Sphäroiden derselben Zelllinie getestet, um die Prädiktivität dieser zwei In-vitro-Modelle zu vergleichen. Zunächst wurden die Test-Bedingungen an CT26-Sphäroiden optimiert, um die Hypoxie und die Zone ruhender Zellen im Inneren von Tumorgewebe widerzuspiegeln. Diese Bedingungen wurden mittels Konfokalmikroskopie nachgewiesen. Weiters wurde die Wirksamkeit der Substanzen mittels eines luminiszenz-basierten ATP-Assays ermittelt, welcher eine vergleichbare Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen in 2D und 3D Kulturen erlaubt. Die erhaltenen IC50-Werte sowie deren 3D/2D-Quotienten wurden mittels Korrelationsanalyse mit den Ergebnissen der In-vivo-Testungen verglichen. Die Analyse ergab eine höhere Korrelation der IC50 Werte in HCT116- und CT26-Sphäroiden mit der Wachstumshemmung in murinen CT26 Tumormodellen, als die entsprechenden Werte in Monolayer-Kulturen. Um eine höhere Prädiktivität von Hochdurchsatz-Screenings zu erreichen wird der Einsatz von multizellulären Tumor-Sphäroiden empfohlen.
Abstract (eng)
There is a high divergence in anti-cancer drug development between the number of substances that show promising activity in vitro and those for which activity can be confirmed in vivo in animal models. Optimized conditions for in vitro compound testing could lead to a reduction of necessary animal experiments by increasing the accuracy in substance preselection. Advances in compound testing include the implemented use of multicellular tumor spheroids (3D cell culture) in high-throughput screenings. They exhibit characteristics of tumor tissue such as hypoxia and quiescence and resemble their tissue of origin more closely in terms of morphology and gene expression than monolayer cell culture. This is why a higher predictivity for in vivo activity has generally been attributed to them despite a lack of clear evidence. From the variety of compounds synthesized at the Institute of Inorganic Chemistry of the University of Vienna more than 30 were already tested in a murine colon carcinoma model (CT26) in vivo. These substances comprise Pt(II), Pt(IV), La(III), Ru(II), Ru(III), Ga(III), Os(II), Rh(III) and Mo(IV) complexes as well as thiosemicarbazones. The data obtained from these experiments were the basis for analyzing the predictivity of different in vitro tests for in vivo activity. For this purpose, cytotoxicity testing in two colon cancer cell lines was carried out in this master thesis, using CT26 (murine) and HCT116 (human) cells in monolayer and spheroid cultures in parallel. In a first step, test conditions in CT26 spheroids were optimized to mimic hypoxia and quiescence in inner layers of tumor tissue. These conditions were confirmed via confocal microscopy. This was followed by cytotoxicity tests, using a luminescence-based ATP assay which facilitates sensitive and analogous testing of cell viability in both 2D and 3D cell culture. The received IC50 values and 3D/2D quotients thereof were compared with in vivo results using correlation analysis. Higher correlation between IC50 values in HCT116 and CT26 spheroid culture with in vivo results in the murine colon carcinoma CT26 tumor model compared to corresponding values in monolayer culture was proven. The use of multicellular spheroids for high-throughput testing is recommended to achieve a higher predictivity for in vivo results.
Keywords (deu)
Krebs3D Zellkulturmultizelluläre SphäroidePt(II)Pt(IV)Ru(II)Ru(III)Ga(III)Thiosemicarbazone
Keywords (eng)
multicellular tumor spheroids3D cell cuture
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Extent (deu)
vi, v, 118 Seiten : Illustrationen
Number of pages
130
Study plan
Masterstudium Biologische Chemie
[UA]
[066]
[863]
Association (deu)
Title (eng)
Investigating the predictive power of in vitro drug testing in multicellular spheroids for in vivo activity
Author
Ramona Velasco-Pelaez
Abstract (deu)
Bei der Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von Krebs gibt es eine Diskrepanz zwischen der Anzahl an Substanzen, welche vielversprechende Ergebnisse in vitro zeigen, und jenen, welche auch im Tiermodell Wirksamkeit aufweisen. Um die Anzahl der Tierversuche zu reduzieren und eine höhere Treffsicherheit in der Vorauswahl von Substanzen zu erreichen, wurden die In-vitro-Testbedingungen optimiert. Entwicklungen der letzten Jahre ermöglichen die Verwendung von multizellulären Tumor-Sphäroiden (3D Zellkultur) im Hochdurchsatz-Screening. Diese weisen gewisse Charakteristika von Tumoren auf (Hypoxie, Nekrose) und ähneln stärker dem ursprünglichen Tumorgewebe hinsichtlich Morphologie und Genexpression. Daher wird ihnen eine höhere Prädiktivität für In-vivo-Aktivität zugeschrieben, wofür jedoch kaum Evidenz vorliegt. Von den zahlreichen am Institut für Anorganische Chemie der Universität Wien synthetisierten Verbindungen wurden bereits mehr als 30 an einem Kolonkarzinommodell (CT26) in vivo getestet. Dabei handelt es sich um Pt(II)-, Pt(IV)-, La(III)-, Ru(II)-, Ru(III)-, Ga(III)-, Os(II)-, Rh(III)- und Mo(IV)-Verbindungen, sowie Thiosemicarbazone. Die daraus gewonnenen Daten dienen nun als Grundlage, die Vorhersagekraft verschiedener In-vitro-Testmethoden zu untersuchen. Hierzu wurden im Laufe dieser Masterarbeit 29 Substanzen parallel in zwei Darmkrebs-Zelllinien, CT26 (murin) sowie HCT116 (human), in 2D Zellkulturen sowie an multizellulären Sphäroiden derselben Zelllinie getestet, um die Prädiktivität dieser zwei In-vitro-Modelle zu vergleichen. Zunächst wurden die Test-Bedingungen an CT26-Sphäroiden optimiert, um die Hypoxie und die Zone ruhender Zellen im Inneren von Tumorgewebe widerzuspiegeln. Diese Bedingungen wurden mittels Konfokalmikroskopie nachgewiesen. Weiters wurde die Wirksamkeit der Substanzen mittels eines luminiszenz-basierten ATP-Assays ermittelt, welcher eine vergleichbare Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen in 2D und 3D Kulturen erlaubt. Die erhaltenen IC50-Werte sowie deren 3D/2D-Quotienten wurden mittels Korrelationsanalyse mit den Ergebnissen der In-vivo-Testungen verglichen. Die Analyse ergab eine höhere Korrelation der IC50 Werte in HCT116- und CT26-Sphäroiden mit der Wachstumshemmung in murinen CT26 Tumormodellen, als die entsprechenden Werte in Monolayer-Kulturen. Um eine höhere Prädiktivität von Hochdurchsatz-Screenings zu erreichen wird der Einsatz von multizellulären Tumor-Sphäroiden empfohlen.
Abstract (eng)
There is a high divergence in anti-cancer drug development between the number of substances that show promising activity in vitro and those for which activity can be confirmed in vivo in animal models. Optimized conditions for in vitro compound testing could lead to a reduction of necessary animal experiments by increasing the accuracy in substance preselection. Advances in compound testing include the implemented use of multicellular tumor spheroids (3D cell culture) in high-throughput screenings. They exhibit characteristics of tumor tissue such as hypoxia and quiescence and resemble their tissue of origin more closely in terms of morphology and gene expression than monolayer cell culture. This is why a higher predictivity for in vivo activity has generally been attributed to them despite a lack of clear evidence. From the variety of compounds synthesized at the Institute of Inorganic Chemistry of the University of Vienna more than 30 were already tested in a murine colon carcinoma model (CT26) in vivo. These substances comprise Pt(II), Pt(IV), La(III), Ru(II), Ru(III), Ga(III), Os(II), Rh(III) and Mo(IV) complexes as well as thiosemicarbazones. The data obtained from these experiments were the basis for analyzing the predictivity of different in vitro tests for in vivo activity. For this purpose, cytotoxicity testing in two colon cancer cell lines was carried out in this master thesis, using CT26 (murine) and HCT116 (human) cells in monolayer and spheroid cultures in parallel. In a first step, test conditions in CT26 spheroids were optimized to mimic hypoxia and quiescence in inner layers of tumor tissue. These conditions were confirmed via confocal microscopy. This was followed by cytotoxicity tests, using a luminescence-based ATP assay which facilitates sensitive and analogous testing of cell viability in both 2D and 3D cell culture. The received IC50 values and 3D/2D quotients thereof were compared with in vivo results using correlation analysis. Higher correlation between IC50 values in HCT116 and CT26 spheroid culture with in vivo results in the murine colon carcinoma CT26 tumor model compared to corresponding values in monolayer culture was proven. The use of multicellular spheroids for high-throughput testing is recommended to achieve a higher predictivity for in vivo results.
Keywords (deu)
Krebs3D Zellkulturmultizelluläre SphäroidePt(II)Pt(IV)Ru(II)Ru(III)Ga(III)Thiosemicarbazone
Keywords (eng)
multicellular tumor spheroids3D cell cuture
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Number of pages
130
Association (deu)
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