Title (eng)
Expression, purification and characterisation of selected marfuraquinocin biosynthetic enzymes
Author
Laura Maria Groschedl
Advisor
Sergey Zotchev
Co-Advisor
Olha Schneider
Abstract (deu)
Der Anstieg antibiotikaresistenter Mikroorganismen betont die dringende Notwendigkeit neuer antiinfektiver Wirkstoffe. Naturstoffe gelten weiterhin als vielversprechende Quelle für bioaktive Verbindungen, ihre industrielle Nutzung wird jedoch häufig durch hohe Wiederentdeckungsraten oder begrenzte Produktionsmöglichkeiten erschwert. Diese Masterarbeit konzentriert sich auf meroterpenoide Naturstoffe marinen Ursprungs, insbesondere Marfuraquinocine, die von Streptomyces Arten produziert werden und deren Biosynthese, welche bislang noch nicht aufgeklärt wurde. Zur Aufklärung dieser Wege wurden Methoden der functional genomics eingesetzt – der Ansatz der heterologen Expression und CRISPR/Cas9- basierte Genom-Editierung. Sechs biosynthetische Gene wurden in Escherichia coli BL21 als heterologem Wirtsystem exprimiert und anschließend mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Für fünf der sechs Zielproteine konnte eine erfolgreiche Expression und Aufreinigung erzielt werden, was eine weiterführende funktionelle Charakterisierung dieser Proteine ermöglicht. Zur Validierung der Genfunktion wurden gezielte Gen-Deletionen mithilfe von CRISPR/Cas9 durchgeführt. Nach Fermentation der Kulturen wurden die Extrakte zweier Konstrukte mittels LC-MS analysiert und mit dem Wildtyp verglichen. Die Ergebnisse zeigten unterschiedliche Metabolitenprofile, was auf eine Beteiligung der deletierten Gene in der Marfuraquinocin Biosynthese hinweist. Diese Arbeit demonstriert den Nutzen von Genome Mining und synthetischer Biologie zur Aufklärung komplexer Biosynthesewege und zur Optimierung der Naturstoffforschung. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zu einem tieferen Verständnis der Marfuraquinocin Biosynthese bei und ebnen den Weg für die zukünftige Entwicklung neuartiger Meroterpenoid derivatisierter Wirkstoffe.
Abstract (eng)
The rise of antibiotic-resistant microbes emphasises the urgent need for novel anti-infective agents. Natural products remain a promising source of new bioactive compounds; however, their industrial exploration is often challenged by high rediscovery rates or limited product scalability. This thesis focuses on marine-derived meroterpenoids, specifically marfuraquinocins produced by Streptomyces species, whose biosynthetic pathways remain incompletely understood. To address this, functional genomic methods were employed, combining heterologous expression approaches and CRISPR/Cas9- mediated genome engineering. Six biosynthetic genes were cloned and expressed in Escherichia coli BL21 as heterologous host, followed by nickel-NTA affinity chromatography. Successful expression and purification were achieved for five of six target proteins, enabling further functional characterisation. To validate gene function, CRISPR/Cas9 was used to generate targeted gene deletions. After fermenting the cultures, the extracts of two engineered constructs were analysed by LC-MS and compared to the wildtype. This revealed diverse metabolite profiles, indicating the involvement of the deleted genes in marfuraquinocin biosynthesis. This work demonstrates the utility of genome mining and synthetic biology tools in elucidation of complex biosynthetic pathways and optimising natural product discovery. The findings contribute to a deeper understanding of marfuraquinocin biosynthesis and pave the way for future engineering of novel meroterpenoid derivative drugs.
Keywords (deu)
Pharmazeutische BiotechnologieNaturstoffeSekundärmetabolismusBiosynthetische GenclusterHeterologe ExpressionCRISPR-Cas9Marfuraquinocine
Keywords (eng)
Pharmaceutical biotechnologyNatural productsSecondary metabolismBiosynthetic gene clusterHeterologous expressionCRISPR-Cas9Marfuraquinocins
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Extent (deu)
61 Seiten : Illustrationen
Number of pages
62
Study plan
Masterstudium Pharmazie
[UA]
[066]
[605]
Association (deu)
Title (eng)
Expression, purification and characterisation of selected marfuraquinocin biosynthetic enzymes
Author
Laura Maria Groschedl
Abstract (deu)
Der Anstieg antibiotikaresistenter Mikroorganismen betont die dringende Notwendigkeit neuer antiinfektiver Wirkstoffe. Naturstoffe gelten weiterhin als vielversprechende Quelle für bioaktive Verbindungen, ihre industrielle Nutzung wird jedoch häufig durch hohe Wiederentdeckungsraten oder begrenzte Produktionsmöglichkeiten erschwert. Diese Masterarbeit konzentriert sich auf meroterpenoide Naturstoffe marinen Ursprungs, insbesondere Marfuraquinocine, die von Streptomyces Arten produziert werden und deren Biosynthese, welche bislang noch nicht aufgeklärt wurde. Zur Aufklärung dieser Wege wurden Methoden der functional genomics eingesetzt – der Ansatz der heterologen Expression und CRISPR/Cas9- basierte Genom-Editierung. Sechs biosynthetische Gene wurden in Escherichia coli BL21 als heterologem Wirtsystem exprimiert und anschließend mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Für fünf der sechs Zielproteine konnte eine erfolgreiche Expression und Aufreinigung erzielt werden, was eine weiterführende funktionelle Charakterisierung dieser Proteine ermöglicht. Zur Validierung der Genfunktion wurden gezielte Gen-Deletionen mithilfe von CRISPR/Cas9 durchgeführt. Nach Fermentation der Kulturen wurden die Extrakte zweier Konstrukte mittels LC-MS analysiert und mit dem Wildtyp verglichen. Die Ergebnisse zeigten unterschiedliche Metabolitenprofile, was auf eine Beteiligung der deletierten Gene in der Marfuraquinocin Biosynthese hinweist. Diese Arbeit demonstriert den Nutzen von Genome Mining und synthetischer Biologie zur Aufklärung komplexer Biosynthesewege und zur Optimierung der Naturstoffforschung. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zu einem tieferen Verständnis der Marfuraquinocin Biosynthese bei und ebnen den Weg für die zukünftige Entwicklung neuartiger Meroterpenoid derivatisierter Wirkstoffe.
Abstract (eng)
The rise of antibiotic-resistant microbes emphasises the urgent need for novel anti-infective agents. Natural products remain a promising source of new bioactive compounds; however, their industrial exploration is often challenged by high rediscovery rates or limited product scalability. This thesis focuses on marine-derived meroterpenoids, specifically marfuraquinocins produced by Streptomyces species, whose biosynthetic pathways remain incompletely understood. To address this, functional genomic methods were employed, combining heterologous expression approaches and CRISPR/Cas9- mediated genome engineering. Six biosynthetic genes were cloned and expressed in Escherichia coli BL21 as heterologous host, followed by nickel-NTA affinity chromatography. Successful expression and purification were achieved for five of six target proteins, enabling further functional characterisation. To validate gene function, CRISPR/Cas9 was used to generate targeted gene deletions. After fermenting the cultures, the extracts of two engineered constructs were analysed by LC-MS and compared to the wildtype. This revealed diverse metabolite profiles, indicating the involvement of the deleted genes in marfuraquinocin biosynthesis. This work demonstrates the utility of genome mining and synthetic biology tools in elucidation of complex biosynthetic pathways and optimising natural product discovery. The findings contribute to a deeper understanding of marfuraquinocin biosynthesis and pave the way for future engineering of novel meroterpenoid derivative drugs.
Keywords (deu)
Pharmazeutische BiotechnologieNaturstoffeSekundärmetabolismusBiosynthetische GenclusterHeterologe ExpressionCRISPR-Cas9Marfuraquinocine
Keywords (eng)
Pharmaceutical biotechnologyNatural productsSecondary metabolismBiosynthetic gene clusterHeterologous expressionCRISPR-Cas9Marfuraquinocins
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Number of pages
62
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