Die nicht-kodierende Xist RNA ist entscheidend für die Initiation der chromosomweiten
Genrepression während der X-Inaktivierung in weiblichen Säugetierzellen. Die
Stilllegung X-spezifischer Gene ist abhängig von einer sich wiederholenden Sequenz
am 5´Ende von Xist. Untersuchungen an murinen embryonalen Stammzellen zeigten,
dass dieses sogenannte „repeat A“-Element essenziell für die Initiation der
Genrepression durch Xist ist. Es wurde gezeigt, dass die Expression einer Xist RNA mit
fehlendem repeat A zwar alle charakteristischen Chromatinmodifikationen herbeiführen
kann, Gene an diesem Chromosom jedoch aktiv bleiben.
In diesem Projekt wird untersucht, ob eine solche Chromosomen-Konfiguration mit der
embryonalen Entwicklung vereinbar ist. Dafür wurde ein transgenes Mausmodell
etabliert, bei dem die Expression einer Xist RNA mit fehlendem repeat A am 3´Ende
des Col1a1 Locus am Chromosom 11 mittels Doxyzyklin induzierbar ist. Es wird
gezeigt, dass die Expression der mutierten Xist RNA zu Histon H3 - Lysin 27-
trimethylierung (H3K27m3) führt, jedoch keine erkennbare Histon H4 - Deacetylierung
beobachtet werden kann.
Die Expression der transgenen Xist RNA ohne repeat A in vivo in der frühen
embryonalen Entwicklung zeigt einen starken, unerwarteten Phänotyp, der zu
embryonaler Letalität vor Tag 9.5 der Embryonalentwicklung führt (E9.5).
Interessanterweise wurde dieser Phänotyp ebenso bei heterozygoter Expression des
Transgens beobachtet und ist unabhängig von der parentalen Herkunft der Xist RNA.
Expression in einem späteren Stadium der Entwicklung (E11.5) zeigt keinen
offensichtlichen Phänotyp was darauf hinweisen könnte, dass Genexpressionsmuster in
der frühen embryonalen Entwicklung durch epigenetische Modifikationen gestört
werden.
Um den molekularen Mechanismus des beobachteten Phänotyps zu untersuchen,
wurden embryonale Stammzelllinien aus Blastocysten etabliert, welche homozygot
induzierbare Xist RNA ohne repeat A am Chromosom 11 tragen. Mit Hilfe dieses
in vitro Systems wurde eine genomweite Genexpressionsanalyse mittels Affymetrix
Maus Array durchgeführt. Drei unabhängig voneinander isolierte embryonale
Stammzelllinien wurden mit Retinolsäure für 5 Tage entweder mit oder ohne
Doxyzyklin differenziert und die Unterschiede in der Genexpression zwischen
induzierten und nicht induzierten Zelllinien verglichen. Die Ergebnisse zeigen nur
minimale Unterschiede in der Genexpression. Ein höherer Prozentsatz an
herunterregulierten Genen konnte am Chromosom 11 beobachtet werden was darauf
hinweist, dass Expression der transgenen Xist RNA ohne repeat A eine verbleibende
Funktion in der Gen-Stilllegung im autosomalen Kontext aufweist. Die am stärksten
herunterregulierten Gene sind keine Zielgene für Polycomb-Komplexe und scheinen in
der Differenzierung herunterreguliert zu werden.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Expression einer transgenen Xist
RNA ohne repeat A vom Chromosom 11 zwar H3K27m3 etabliert, jedoch keine
signifikante H4 Deacetylierung beobachtet werden kann. Dreiviertel der Gene, die am
Chromosom 11 lokalisiert sind, werden in geringem Ausmaß herunterreguliert, was
offensichtlich mit der embryonalen Entwicklung der Maus nicht vereinbar ist. Es ist
anzunehmen, dass die betroffenen Gene notwendig sind für spezifische
Differenzierungswege in der frühen embryonalen Entwicklung und bereits geringe
Änderungen in der Expression zu embryonaler Letalität führen

The non-coding Xist RNA is the trigger of chromosome-wide gene repression during
X inactivation in mammals. Gene repression depends on a repeated sequence on the 5´
of Xist. Studies in mouse embryonic stem cells (ESCs) have shown that this repeat A
element is essential for the initiation of gene silencing by Xist. Expression of Xist
lacking repeat A has been shown to lead to an X chromosome which possesses all
chromatin modifications of the inactive X chromosome (Xi) but genes remain active.
Here, we investigate if such a chromosome configuration can be compatible with
development. For this we have established mice harbouring transgene for inducible
expression of repeat A deleted Xist RNA from the Col1a1 locus on chromosome 11. We
show that induction of Xist lacking repeat A in embryonic cells leads to histone H3
lysine 27 tri-methylation (H3K27m3) but no noticeable decrease in histone H4
acetylation. Our experiments reveal an unexpected strong phenotype leading to
embryonic lethality most likely before embryonic day 9.5. Notably, the phenotype was
observed also in mice heterozygous for the transgenic chromosome 11 and independent
of the parental origin of the transgene. However, no obvious phenotype could be
observed after late induction of Xist. This suggests that in early development gene
expression patterns might be disrupted by epigenetic modifications triggered by Xist
without repeat A.
To investigate the molecular basis of this phenotype we have established ESCs from
homozygous transgene bearing blastocysts and performed genome-wide gene
expression profiling using Affymetrix mouse array analysis of three independently
derived ES cell lines either with induction of Xist or without. We compared expression
differences between induced and non-induced cells after 5 days of differentiation with
retinoic acid. Our results show only little misregulation of genes with low fold changes.
However, we could investigate a higher percentage of downregulated genes on
chromosome 11 which suggests remaining silencing function of transgenic Xist RNA
lacking repeat A in an autosomal context. Most significantly downregulated genes are
no Polycomb target genes and seem to be downregulated upon differentiation. The
assumption that developmental genes are prevented to be upregulated upon
differentiation by transgenic Xist RNA expression could not be confirmed.
Overall, our results show that expression of Xist RNA lacking repeat A from
chromosome 11 establishes H3K27m3, but no significant H4 hypoacetylation. Genes on
this modified chromosome are slightly downregulated which is obviously not
compatible with mouse embryonic development. We suggest that misregulated genes on
chromosome 11 are necessary for a lineage specific differentiation pathway early in
development and already little downregulation causes embryonic lethality