RNA-Interferenz (RNAi) ist eine kürzlich entdeckte Technik des Gen-Silencing. Dieses Verfahren basiert auf einer spezifischen Interferenz einer RNA-Sequenz von ungefähr 21 Nukleotiden, auch short interfering RNA (siRNA) genannt. Diese sind komplementär in der Sequenz zur entsprechenden Boten-RNA (mRNA). Die Erkennung fördert den Abbau und hemmt die Expression der Ziel-Boten-RNA.
Die effiziente Zellaufnahme von siRNA ist zurzeit eine große Herausforderung. Während verschiedene Modifikationen der siRNA-Sequenz und mehrere Formulierungen untersucht worden sind, konnte bisher keine von ihnen die gewünschten Anforderungen vollständig erfüllen und ausreichende Sicherheit und Effizienz für eine therapeutische Anwendung gewährleisten.
Während dieser Diplomarbeit habe ich die Synthese und Darstellung von PEG-siRNA Konjugaten gestaltet und ihre Wirkung in Bezug auf die Aufnahme und Reduktion des Bcl-2 Gens in Säugerzellen untersucht.
Im Rahmen der Diplomarbeit wurden zunächst anti-Bcl-2 siRNA synthetisiert und gereinigt. Anschließend wurden PEG-Ketten definierter Länge an die 3'-und 5'-Enden der Sense- und Antisense-Stränge der siRNA-Oligonukleotide angehängt. Eine Modifikation mit PEG an der 5'-OH-Gruppe wurde mithilfe eines PEG-Phosphoramidit-Bausteins am Ende der RNA-Synthese versucht, was jedoch nur zu geringen Ausbeuten des Konjugats führte. PEG-Ketten wurden an das 3'-Ende der siRNA nach der Reaktion eines Aminohexyl-Linkers mit NHS-Ester aktiviertem PEG eingeführt. Die Konjugationsreaktion war mit ungefähr 75% der siRNA-Stränge mit einer Aminohexyl-Gruppe erfolgreich.
Die HPLC-Analyse ermöglichte Quantifizierung der Konjugationsreaktion und semipräparative Reinigung der Produkte; ESI-MS lieferte Daten über das Molekulargewicht der siRNA und der Reaktionsprodukte; Gelelektrophorese wurde verwendet, um die Reinheit von siRNA zu analysieren und die Umsetzung der Reaktion mit PEG zu verfolgen.
Der Einfluss der PEG-Konjugate auf das Knockdown der entsprechenden Bcl-2-mRNA in einem Säugerzellkultur-Modell (MCF-7-Zellen) wurde unter Verwendung eines Luciferase-Reporter-Assays und durch Quantifizierung der endogenen mRNA durch RT-qPCR untersucht. Nach einer Transfektion mit LipofectamineTM2000, PEGylierte siRNA erzielten eine starke Herunterregulierung. Dies weist darauf hin, dass eine PEGylierung am 3’-Ende beider Stränge keinesfalls zum Wirkungsverlust führt. Auftragen von nackten siRNAs zeigte keine signifikante Herunterregulierung des gezielten Gens.
Obwohl die Polyethylenglykolketten, am 3'-Ende gebunden, die Transfektion von siRNA in Säugetierzellen nicht effektiv verbessern, beweist meine Arbeit die Toleranz der Effektormoleküle für solche Modifikation. Diese Konjugate können daher für Lipid- und Polymersysteme verwendet werden, welche als realisierbare Strategien zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit, Verlängerung der Plasmahalbwertszeiten und Verbesserung der Stabilität gelten.

RNA interference (RNAi) is a recently discovered technique of gene silencing. It is based on a specific interference of a RNA sequence of approximately 21 nucleotides, called short interfering RNA (siRNA), which is complementary to a messenger RNA (mRNA) of interest. After hybridisation, the target mRNA is degraded and its expression inhibited.
The delivery of siRNA into cells has been a great challenge. While various modifications of the siRNA sequence and several delivery systems have been examined, so far none of them could fully meet the requirements for safe and efficient therapeutic application.
During this diploma thesis, I devised a synthetic procedure for the preparation of PEG-siRNA oligonucleotides and investigated the effect on their uptake and down-regulation of the targeted Bcl-2 gene in mammalian cells.
At first, anti-Bcl-2 siRNAs were synthesised and purified. Subsequently PEG chains of defined length were attached at the 3’- and 5’-ends of sense and antisense strands of the siRNA oligonucleotides. Conjugation of PEG at the 5’-OH group was carried out with a PEG-phosphoramidite building block added at the end of the RNA synthesis, but resulted in low yields. PEG chains were attached at the 3’-end post-synthetically by reaction of a NHS-ester activated polyethylene glycol to an aminohexyl modified oligonucleotide. The conjugation reaction showed approximately 75% conjugation yields.
The molecular weight of siRNA and its conjugates was analysed with ESI-MS. PAGE enabled analysis of purity and efficiency of the conjugation reaction. Quantification of the conjugation reaction and purification of the components was carried out with HPLC.
The influence of the PEG conjugates on the knockdown of the corresponding Bcl-2 mRNA was examined in a mammalian cell culture model (MCF-7 cells) by making use of a Dual-Luciferase Reporter Assay and by quantification of endogenous mRNA levels by RT-qPCR. After LipofectamineTM2000 transfection, PEGylated siRNA resulted in strong knockdown, indicating no loss of activity through the 3’-end conjugation of both strands. Naked application showed no significant down-regulation of the target gene.
Although the polyethylene glycol chains could not effectively enhance unassisted siRNA uptake into mammalian cells, my work demonstrates the tolerance of the molecular effectors for 3’-PEGylation. These conjugates can be used for lipid and polymeric delivery systems, and this and similar modifications are viable strategies for increasing the bioavailability of oligonucleotides, prolonging circulation times and increasing stability.