„Lesefehlermutationen“ des AVPR2-Gens, welches für den Vasopressin V2 Rezeptor kodiert, sind die Hauptursache für den angeborenen X-chromosomalen Diabetes Insipidus, der sich durch Vasopressinresistenz der Nieren auszeichnet. Die Konsequenz ist eingeschränkte Harnkonzentrierung und daher eine gestörte Wasserhomöostase. In den meisten Fällen wird die Rezeptorstruktur durch die Mutation destabilisiert. Die zelluläre Qualitätskontrolle erkennt diese Rezeptormutanten als fehlgefaltet und retiniert sie intrazellulär. Diese Retention wird durch Proteine aus dem Spektrum der Chaperon/HSP/Lektinmoleküle vermittelt. Durch den Einsatz synthetischer V2R-Liganden kann die Oberflächenexpression der Rezeptormutanten erhöht werden.

In meiner Arbeit untersuchte ich V2R-Konstrukte mit “Lesefehlermutationen”, die zum Austausch einzelner Aminosäuren führten und durch Transfektion in kultivierbaren Zelllinien zur Expression gebracht wurden. Der Lesefehler betraf in allen untersuchten Konstrukten die kodierende Sequenz der Transmembrandomäne obzwar an unterschiedlichen Segmenten. Jede dieser Mutationen führte zur primären, intrazellulären Lokalisation des Rezeptors. Mit Hilfe hochaffiner, membranpermeierender V2R-Liganden (Tolvaptan und SR121463) wurden Mutanten ausgewählt, die durch Behandlung mit den Liganden an die Zelloberfläche transferierten. Die Veränderung in der Oberflächendichte schätzte ich nach Antikörperfärbung des Rezeptors mittels FACS. Meine Daten zeigen, dass der Pharmakochaperoneffekt abhängig von der Position der Mutation war; von sieben Mutanten reagierten nur jene mit Lesefehlermutationen in Transmembranhelices 6 (T273R) bzw. 7 (S318I) auf die Behandlung mit Ligand. Die apparente Affinität der Liganden für die Rezeptorfaltungsintermediate (~0,3 – 3 µM) lag Größenordnungen unter jener für den Wildtyprezeptor (~0,5 nM).

Vermutlich kam ein Teil des Pharmakochaperoneffekts nach Inkubation mit Ligand durch Stabilisierung des Rezeptors zustande. Der Pharmakochaperoneffekt gestattete, dass die mutanten Rezeptoren an Menge zunahmen und reiften. Analyse GFP-fusionierter Rezeptorkonstrukte auf dem Westernblot zeigte ein im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen ein verändertes Bandenmuster und stärkere Banden. C-terminale Fusion an grün-fluoreszierendes Protein (GFP) führte ebenfalls zur Stabilisierung des Rezeptorpolypeptids (gegenüber Degradation). Wenn die Expression von Rezeptorkonstrukten mit und ohne GFP miteinander verglichen wurde, fand ich eine beträchtliche Überexpression des Fusionskonstrukts im Vergleich zum unfusionierten Rezeptor. Die Expressionszunahme war zumindest zwanzigfach. Der fusionierte Rezeptor war im Gegensatz zu unfusioniertem mit nativen Carboxyterminus geeignet, eine Wiederherstellung der Rezeptorfunktion nach Pharmakochaperonbehandlung zu demonstrieren.

Die Retention von fehlgefalteten Rezeptormutanten ist eine Funktion der zellulären Qualitätskontrolle. Ich untersuchte die Wirkung des Antibiotikums Geldanamycin, das an das Faltungschaperon HSP90 bindet und dessen ATP-abhängige Funktion hemmt. Meine Daten zeigen, dass die Behandlung mit dem Geldanamycinderivat 17-DMAG die Oberflächenexpression des V2R erhöhte. Der Effekt betraf die mutanten Rezeptoren ebenso wie den Wildtyprezeptor und war unabhängig von der Wirkung der Pharmakochaperone. Zusammen steigerten 17-DMAG und der Pharmakochaperonligand die Oberflächenexpression mehr als jedes für sich allein. Tatsächlich ließ sich nach Immunpräzipitation des Rezeptors eine Assoziation mit dem Geldanamycinsubstrat HSP90 nachweisen. Selbst unter den denaturierenden Bedingungen der SDS-Gelelektrophorese fand sich der Rezeptor mit HSP90 in einem supramolekularen Proteinkomplex wieder, und dies galt gleichermaßen für den wildtypischen und den mutanten Rezeptor. Die Rezeptor-HSP90 Aggregate traten lediglich akut nach Transfektion auf; aus stabil exprimierenden Zelllinien war mit dem Rezeptor HSP90 lediglich spurenweise und in nicht aggregierter Form zu immobilisieren. Ich untersuchte in Ansätzen den Grund für die der Transfektion folgende Aggregatbildung, die reproduzierbar mit einer exzessiven Überexpression des Rezeptorproteins einherging. Immunpräzipitation von HSP90 zeigte, dass sich nach Transfektion HSP90 mit HSP70 und HOP Komplexe bildeten. Die Assoziation mit HSP70 und HOP war im Vergleich zu den stabilen Linien und auch zu Kontrollzellen gesteigert. Meine Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, dass HSP90 als Messstelle für die Zelloberflächenexpression des V2-Rezeptors fungiert und seine Bindungsavidität durch Zellstress, wie eben bei Überladung des ER, enthemmt wird.

Point mutations in the AVPR2-gene, which codes for the Vasopressin V2 Receptor (V2R), are the main cause of X-linked Diabetes Insipidus. The disease is characterized by resistance of the kidneys to Arginine-Vasopressin and, consequentially, failure to concentrate urine and loss of water. In most cases the protein structure of the V2R is destabilized by the mutation. Such receptor mutants are detected as misfolded and retained within the cell. Cellular quality control is most likely mediated by Chaperone/HSP/Lectin molecules. The surface expression of retained receptor mutants can be increased by treatment with synthetic, cell permeable V2R-antagonists, such as SR121463 and Tolvaptan in a process termed pharmacochaperoning.

I expressed in mammalian cells V2R mutants with single amino acid substitutions in their transmembrane segments. The point mutations were located in the coding sequence of the transmembrane domain, albeit each mutation in a different segment. Any of these mutations caused the primary intracellular location of the receptor. I estimated the surface density by FACS after antibody staining of the receptor. My data indicate that the pharmacochaperoning effect depends on the position of the mutation – out of 7 mutants tested only those with substitutions in the transmembrane helix 6 or 7, T273R or S318I respectively, were susceptible to ligand treatment. The affinity of the ligands for the immature folding intermediates (~0.3 – 3µM) was magnitudes lower than for the wild type (~0.5nM).

The pharmacochaperoning effect was accompanied by stabilisation of the receptor protein. By immunoblotting I showed that incubation with pharmacochaperones increased the stability and maturation of receptor constructs that were C-terminally fused to GFP. Comparison of the expression levels of receptor constructs with and without GFP showed that GFP-fusion itself had a stabilising effect on the receptor proteins. The increase in expression of the GFP-fused construct was at least 20-fold relative to the unfused receptor. Restored signalling was demonstrated after pharmacochaperone treatment of GFP-fused receptor mutants, not of those with unfused carboxyterminus.

The retention of incorrectly folded receptor mutants is a basic function of cellular quality control.
I investigated whether the HSP90-inhibitor 17-DMAG increased surface expression of the receptor, both mutant and wild-type. 17-DMAG and pharmacochaperone ligands acted independently; a combination increased surface expression more than the individual agent alone. Immunoprecipitation of the receptor revealed its association with HSP90. The receptor, mutant as well as wild-type, was found together with HSP90 in a supramolecular complex that persisted even under the denaturing conditions of SDS-PAGE. These receptor-HSP90 aggregates were detected only briefly after transfection. In cell lines stably expressing the receptor, only trace amounts of HSP90 were co-precipitated with the receptor and these were in monomeric, non-aggregated form. Aggregate formation correlated reproducibly with excessive overexpression of the receptor. I therefore characterized HSP90-associates shortly after transfection and compared them to those in stable lines. By precipitation of HSP90 from acutely transfected cells I showed that complexes with HSP70 and HOP were increased relative to the stable lines (and to the non-transfected controls). These data support the interpretation that HSP90 is a quality control checkpoint for the surface expression of the Vasopressin V2 Receptor.