Tumorkachexie ist eine schwere Stoffwechselstörung, welche in 50-80% aller Krebserkrankungen auftritt. Tumorkachexie wird nur im Endstadion von Tumorerkrankungen beobachtet und führt zu einem massiven Verlust an Körperfett und Muskelmasse. Kachexie ist verantwortlich für den Tod von rund 20% aller Krebspatienten und ihre biologischen Ursachen sind derzeit nur wenig verstanden. Neuste Studien zeigten jedoch, dass die Fähigkeit Kachexie zu induzieren nicht nur vom Tumortyp allein, sondern auch von seiner Umgebung abhängt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung bzw. das Finden von Veränderungen im Blutserumproteom, welche charakteristisch für Tumorkachexie sind. Hierfür wurde ein ungezieltes hochauflösendes MS basierendes Screening (Q Exactive) mit einer gezielten MRM/MS Analysestrategie (QqQ) kombiniert. Blutserumproben von kachektischen und nicht kachektischen austherapierten Melanom Patienten wurden dankenswerter Weise von Prof. Reichle (Universitätsklinikum Regensburg) bereitgestellt, während gesunde Referenzproben im Haus genommen wurden. Zwei unterschiedliche Probenaufbereitungstechniken, nämlich Fraktionierung mittels SDS PAGE und Depletion, wurden basierend auf ihren Ergebnissen in der Shotgun Analyse evaluiert. Dabei zeigte sich, dass Depletion zu einer höheren Anzahl an detektierbaren Proteinen mit größerer biologischer Signifikanz führt. Depletion der Serumproben in Kombination mit einem Proteinverdau in Lösung wurde daher für alle weiteren Experimente herangezogen. Zur Bestimmung potentiell regulierter Proteine wurden drei Proben aus jeder Kohorte (kachektisch, nicht kachektisch, gesund) mittels Shotgun MS untersucht. Die Proteinidentifikation wurde mittels MaxQuant Suche gegen die Humane Proteome Datenbank durchgeführt. Der in MaxQuant implementierte „Label free quantification“ Algorithmus wurde zur relativen Quantifizierung aller identifizierten Proteine in den biologischen Gruppen herangezogen. Eine statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels Perseus. Zielproteine für die MRM/MS Analyse waren jene mit signifikanter Konzentrationsänderung (Unterschied ≥ 2-fach; p ≤ 0.05) und hoher biologischer Signifikanz. Basierend auf den hochauflösenden MS Daten, wurden Peptide und die korrespondierenden interferenzfreien Vorläufer Ionen für jedes der Zielproteine ausgewählt. 93 Proteine (188 Peptide) wurden für die statischen MRM Messungen herangezogen und nur interferenzfreie Übergänge, die ein rauscharmes Signal zeigten, wurden weiter prozessiert. Aus den aufgenommenen Daten wurde ein dynamisches MRM Assay für 58 Proteine (92 Peptide) entwickelt. Die validierte Methode wurde dann zur schnellen (20 min) und präzisen (<25% CV) Analyse von Patientenproben herangezogen. Drei Patienten pro Kohorte wurden dabei untersucht, und die gemessenen Veränderungen im Proteingehalt wurden statistisch auf Signifikanz (Unterschied ≥ 2-fach; p ≤ 0.05) geprüft. Hierbei wurden 13 Kachexie-spezifisch regulierte Proteine gefunden. Diese 13 Proteine sind hauptsächlich in Prozessen der Zelladhäsion und der proentzündlichen Stimulierung beteiligt. Zusätzlich wurden weitere 23 Proteinänderungen mit einer geringen Spezifität für Kachexie entdeckt. Diese Proteine sind zumeist in der Immunantwort und der Tumor Metastasierung involviert. Auch 9 Tumor-spezifisch regulierte Proteine konnten gefunden werden. Diese sind typische Akutphase Proteine. Um die gefundenen Unterscheide im Proteingehalt auf Stabilität zu prüfen bzw. mögliche Trends während des Krankheitsverlaufs zu erkennen, wurde die Expression aller regulierten Proteine über die Zeit bestimmt. Dies wurde für drei kachektische und drei nicht kachektische Patienten durchgeführt. Fünf Serumproben pro Patient (in monatlichen Intervallen) wurden mittels des entwickelten MRM Assays vermessen und Veränderungen im Proteingehalt über die Zeit errechnet. Die Ergebnisse zeigten einen systematischen Trend, der höchstwahrscheinlich durch die Probennahme verursacht wurde, ohne Evidenz für biologische Ursachen. Da die Effekte dieses systematischen Fehlers nicht sehr stark waren, können die meisten gefunden regulatorischen Unterschiede noch immer als signifikant angesehen werden. Trotzdem sollte diese Tatsache für weitere Schritte und zukünftige Projekte unbedingt berücksichtigt werden.
Diese Arbeit präsentiert eine robuste Methode zur schnellen und sensitiven Quantifizierung von 58 Proteinen im humanen Serum. Die eingesetzte kombinative Strategie aus ungezieltem Screening und gezielter Analyse lässt sich einfach implementieren und kann zur Messung einer Vielzahl von klinischen Proben mit hohem Durchsatz verwendet werden. Dies würde letztlich zu einem besseren Verständnis von Tumorkachexie führen und den Weg zu neuen klinischen Anwendungen öffnen.

Cancer cachexia is a serious wasting disorder, observed in 50-80% of all cancer patients. It is developed by final stage cancer patients, leads to the massive loss of body fat and muscle and accounts for up to 20% of all cancer related deaths. The ability to induce cachexia is not only depended on the tumor type, but also on the host factors. However, the driving mechanisms behind that are not fully understood and sufficient treatment methods are not yet available. Aim of this work was to investigate serum proteome alterations characteristic for cancer cachexia. Therefore, an untargeted high resolution MS-based screening (Q Exactive) was combined with a targeted MRM/MS analysis strategy (QqQ). Serum samples from non cachectic and cachectic final stage melanoma patients were kindly provided by Dr. Reichle (Universitätsklinikum Regensburg), whereas healthy serum was gathered in house. Two different serum pre treatment techniques, namely SDS PAGE fractionation and depletion, were compared based on their shotgun MS results. Thereby, it was found that depletion leads to a higher number of quantifiable proteins with better quality. The serum depletion in combination with in solution digestion was then used for all further experiments. For the target protein panel development, three samples per biological group (non cachectic, cachectic, healthy) were analyzed via shotgun MS measurements. Protein identification was performed by searching the shotgun data against a human proteome database using MaxQuant. The implemented Label-free quantification algorithm further was enabled to perform relative protein quantification across the biological groups. Statistical evaluation was thereafter performed using Perseus. An MRM target panel was developed for all significantly regulated proteins (fold change ≥ 2; p ≤ 0.05) with biological significance. Based on the high resolution shotgun data, interference free peptides and precursor ions were selected for unscheduled MRM measurements. 93 proteins (188 peptides) were send for unscheduled MRM measurements and only interference free transitions with sufficient signal intensities were processed further. Based on the unscheduled MRM data, a scheduled MRM assay was developed for 58 highly significant proteins (92 peptides). The MRM assay as well as the serum pre treatment method did undergo thoroughly method evaluation, reviling a highly reproducible method. The evaluated MRM assay was used for rapid (20 min run time) and precise (<25% CV) measurements of patients samples. Three patient samples per biological group were analyzed and the determined protein levels were statistical evaluated for significant regulations (fold change ≥ 2, p ≤ 0.05). Thereby, 13 serum proteins were identified to be specifically regulated in cachectic samples compared to non-cachetic and healthy samples. Those included mainly cell adhesion-associated as well as pro inflammatory proteins. In addition 23 regulated proteins with low specificity to cachexia were discovered. These proteins are mostly involved in the immune response and tumor metastasis. At least a panel of 9 very unspecific tumor-induced regulations was found, containing typical acute phase proteins. As a last step, protein expression of all regulated proteins over time was assessed by the MRM measurements. This was performed for three cachectic and three non cachectic patients, to ensure stability of the possible marker proteins as well as to screen for possible prognostic markers. Five serum samples (donated in monthly intervals) were analyzed per patient and variations in protein expression were calculated over time. The results showed systematic trends that are most likely caused by the serum gathering process and no evidence for biological reasons. As the outcomes of this systematic trend are not very strong, most findings of serum alterations can still be accounted as significant. However for further projects and for the search of progression markers this finding needs to be taken in account.
This work presents a robust workflow for fast and sensitive quantification of 58 proteins in human serum. The demonstrated strategy of combining untargeted screening with a precise target analysis can easily be implemented and thereafter used for the rapid and accurate measurements of a multitude of patient’s samples. This would pave the way towards a better understanding of cancer cachexia and thereby point out possible clinical applications.