TTP ist ein mRNS-destabilisierendes Protein, welches in Zusammenarbeit mit anderen Faktoren den Abbau von Entzündungsmediatoren, ausgehend von der Binding zur Ziel-3´UTR, hervorruft. Die Regulierung von TTP´s mRNS-destabilisierender Aktivität ist komplex und involviert verschiedenste Aspekte wie Expression, zelluläre Lokalisation, posttranslationale Modifizierungen und Interaktion mit anderen trans-agierenden Faktoren, welche cis-regulatorische Elemente binden.
Interessanterweise können TTP und das mRNS-stabilisierende Protein HuR ein überlappendes Repertoire an mRNS-Zielen während einer Entzündungsreaktion binden, darunter wichtige pro-inflammatorische Zytokine (Tnf, Cxcl1, Cxcl2, etc.). Daher wollten wir einen tieferen Einblick in die kooperative Wechselwirkung von TTP mit anderen trans-agierenden Faktoren und deren Einfluss auf die Entzündungsreaktion gewinnen. Durch Immunopräzipitation konnte gezeigt werden, dass TTP mit HuR mittels Ziel-RNS interagiert; eine Interaktion zwischen TTP und Ago2 konnte allerdings nicht festgestellt werden. Darüber hinaus konnte nach der Etablierung eines sequentiellen RNS-IP-Protokolls gezeigt werden, dass mehrere mRNS-Sequenzen (z.B. Tnf, Cxcl2) simultan von TTP und HuR gebunden werden. Die funktionalen Konsequenzen des gleichzeitigen Bindens an mRNS wurde mittels CRISPR/Cas-9 Genom-editierten RAW 264.7 Makrophagen, welche Inaktivierung von TTP, HuR oder beider Gene für TTP und HuR aufweisen, untersucht. Im Allgemeinen hat HuR einen geringen Einfluss auf die mRNS-Stabilität von inflammatorischen Mediatoren und nur Tnf mRNS konnte als eindeutiges Ziel, reguliert durch direkte Konkurrenz zwischen TTP und HuR, identifiziert werden. Weiters wurden RAW 264.7 Makrophagen, welche markiertes TTP vom endogenen Lokus exprimieren, gewonnen. Da TTP in diesen Zellen inhärent exprimiert wird erlaubt dieses System verschiedene Interaktions-Analysen, ohne die Risiken Artefakt-anfälliger Überexpression berücksichtigen zu müssen.

TTP is an mRNA-destabilizing protein that regulates in concert with other factors decay of transcripts of inflammatory mediators upon binding to the target 3´UTR. However, the regulation of TTP´s induced mRNA-destabilizing activity is complex and involves many different facets including expression, cellular localization, posttranslational modifications and interaction with other trans-acting factors.
Interestingly, within the inflammatory response TTP and the mRNA-stabilizing protein HuR can bind an overlapping repertoire of mRNA targets, including important pro-inflammatory cytokines (Tnf, Cxcl1, Cxcl2, etc.). We aimed to obtain deeper insight into the cooperative action of TTP with other factors, which help shaping the inflammatory response. Immunoprecipitation revealed that TTP interacts with HuR in presence of target RNA; however, no interaction of TTP with Ago2 could be detected. Moreover, upon establishment of a novel sequential RNA-IP protocol we could show that some mRNAs (e.g. Tnf, Cxcl2) were simultaneously bound by TTP and HuR. The functional consequences of concomitant binding were examined in CRISPR/Cas-9 genome edited RAW 264.7 macrophages, bearing inactivation of TTP, HuR or both TTP and HuR genes. In general HuR has a minor effect on mRNA stability of inflammatory mediators and only Tnf mRNA was unambiguously identified as target regulated by the direct competition of TTP and HuR. Further, RAW 264.7 cells, expressing tagged TTP from its genomic locus were attained. Since TTP is natively expressed in those cells, this system will allow various interaction analysis without risks associated with artifact-prone overexpression studies.